Разворот в разрыве разделительной полосы: Разворот на перекрестке с разделительной полосой

Разворот запрещен Правилами

Общие запреты разворота установлены требования в пункте 8.11 ПДД. То есть разворот запрещен вне зависимости от наличия знаков или разметки в следующих случаях:

• на пешеходных переходах;
• в тоннелях;
• на мостах, путепроводах, эстакадах и под ними;
• на железнодорожных переездах;
• в местах с видимостью дороги хотя бы в одном направлении менее 100 м;
• в местах остановок маршрутных транспортных средств.

И в пункте 16.1:

16.1. На автомагистралях запрещается:

разворот и въезд в технологические разрывы разделительной полосы;

Рассмотрим некоторые места, где разворот запрещен.

Разворот запрещен на пешеходных переходах

Маневр начинается с начала смены направления и заканчивается когда началось движение в обратном направлении. Ни начинать, ни завершать разворот на пешеходном переходе запрещено.

Запрещенный разворот на пешеходном переходеЗапрещенный разворот на пешеходном переходе. Начало маневра в конце переходаРазрешенный разворот вне перекрестка перед пешеходным переходом

Для разворота перед пешеходным переходом отсутствуют требования к расстоянию до перехода. Не забывайте, как определяются границы пешеходного перехода согласно определению.

Разворот запрещен в местах остановок маршрутных транспортных средств.

Первая ошибка это когда зону запрета разворота определяют по радиусу 15 метров от знака. Это не верно. Во первых расстояние 15 метров относится к запрету остановки, во вторых действие знака распространяется по направлению движения.

Место остановки маршрутного транспортного средства, это место где маршрутное транспортное средство осуществляет остановку для посадки и высадки пассажиров, и никакое другое.

Если есть разметка, то место, где разрешен разворот определить просто. Маневр нужно выполнить не наезжая на эту разметку.

Разрешенный разворот вне перекрестка около остановки маршрутных транспортных средств

Далее первого ряда транспортные остановку не осуществляют и место в левой полосе не является местом остановки.

При отсутствии разметки правила границы места остановки не устанавливают. Есть лишь косвенное подтверждение из пункта 12.4 Правил — 15 метров до и после знака.

Разворот запрещен в местах остановок маршрутных транспортных средств.

Разворот запрещен разметкой

Разметка, которую запрещается пересекать соответственно запрещает и разворот

Разворот запрещен через двойную сплошную.

Обратите внимание! На дорогах с реверсивным движением разворот вне перекрестка запрещен.

Линию 1.9 при отсутствии реверсивных светофоров или когда они отключены разрешается пересекать, если она расположена справа от водителя; при включенных реверсивных светофорах — с любой стороны, если она разделяет полосы, по которым движение разрешено в одном направлении. При отключении реверсивных светофоров водитель должен немедленно перестроиться вправо за линию разметки 1.9.

Линию 1.9, разделяющую транспортные потоки противоположных направлений, при выключенных реверсивных светофорах пересекать запрещается.

Разворот вне перекрестка запрещен на дорогах с реверсивным движением.

Разворот запрещен знаками

Дорожные знаки, которые запрещают разворот вне перекрестка это знак 4.1.1 «Движение прямо», установленный в начале участка дороги.

Разворот вне перекрестка запрещен на дорогах, где установлен знак «Движение прямо».

И знак 5.1 «Автомагистраль»

Разворот запрещен на автомагистралях.

Во всех остальных случаях разворот вне перекрестка разрешен, в том числе и на трамвайных путях.

Знак 3.18.2 — Поворот налево запрещен

В каких направлениях Вам разрешено продолжить движение?

Знак «Поворот налево запрещен» запрещает только поворот налево как таковой. Таким образом, на этом перекрестке вы можете развернуться в разрыве разделительной полосы или продолжить движение в прямом направлении.

Какие знаки разрешают разворот?

Ответ

Правильный ответ — Все.

По какой траектории Вы можете выполнить разворот?

В данной ситуации вы можете выполнить разворот, двигаясь по любой траектории. На перекрестке знак «Поворот налево запрещен» устанавливает запрет лишь на выполнение левого поворота, а вне перекрестка, двигаясь по траектории Б, Вы тоже не нарушаете Правил, ибо прерывистую линию разметки можно пересекать для выполнения маневров в любом месте.

Какие знаки разрешают выполнить разворот?

Знак 3.18.2 «Поворот налево запрещен» (А) запрещает только поворот, но не разворот. Знак 5.7.2 «Выезд на дорогу с односторонним движением» (Б) и знак 5.13.2 «Выезд на дорогу с полосой для маршрутных транспортных средств» (В) также не запрещают разворот на перекрестках таких дорог.

Разворот\поворот на против остановки

Cooller1455,
Ситуация понятная. Есть целая группа вопросов, начинающаяся со слов «я выехал с прилегающей безо всяких знаков на выезде, а оказывается, что за 50 метров до этого места на дороге стоял знак…» А далее у каждого своё (одностроннее движение, запрет остановки и т.п.). Причина ситуации состоит в приписке к определению перекрестка, позволявшей Советскому Союзу экономить народное железо и народную краску на знаки в рамках борьбы за построение коммунизма.
С точки зрения ПДД рассматривается всегда «сферический водитель в вакууме, который знает все знаки в округе и сигналы светофоров со всех сторон одновременно», а значит он ничего нарушить не может. Других водителей по ПДД не бывает. С позиции «штраф» рассматриваются правонарушители. И штраф положен при совпадении двух условий — события правонарушения (факт стоянки в зоне действия знака) и состава правонарушения (вина в правонарушении). Вот на отсутствие второй составляющей и делают упор защищающиеся в подобных делах, приводя, например, записи видеорегистраторов, на которых видно, что никаких предписаний со стороны знаков и разметки по ходу движения не было, а разглядывать стоящие «спиной к водителю» знаки он не обязан.
Сразу приведу контр-аргумент «прилегающая территория не предназначена для сквозного движения», поэтому «я заехал с другой улицы и проехал насквозь» традиционно отметаются судом (но бывают исключения). Значит, надо доказать, что Вы не могли видеть предписаний знаков не только после выезда на эту улицу с прилегающей, но и перед съездом на прилегающую с этой улицы. Никаких гарантий тут никто не даст, но при должном подходе шанс оспорить наказание есть.
На покойном ныне форуме ГАИ.ру были прецеденты, когда отменялись наказания при наличии места разворота, когда после разворота и остановки до знака (теперь уже по направлению движения)
было слишком далеко (т.е. нарушены правила установки и не поставлен промежуточный знак с табличкой 8.2.4), чтобы его разглядеть, либо его вообще не было.

Изучаем, где можно разворачиваться на автомобиле, а где нельзя

Как мы прекрасно знаем, в правилах дорожного движения Украины конкретно не определенны места дорожного полотна, где можно разворачиваться. Там только четко указано, где нельзя совершать разворот. Но, исходя из этих запретов, методом исключения, можем определить, где все-таки можно разворачиваться.

Где разворот разрешен

В первую очередь отмечу, что разворот необходимо исполнять так, чтобы не пересекать сплошную и, при этом, не ехать «по встречке».

Например, из правил следует, что вы можете совершить разворот за пешеходным переходом на перекрестке, но на перекрестке с разделительной полосой, выполнить маневр без выезда на центр перекрестка – нереально.

Важно! Можно совершать разворот на регулируемом перекрестке, при условии, что сигнал светофора и регулировщика разрешают это сделать. Только не забудьте пропустить встречный транспорт.

Такие же действия вы можете совершать на нерегулируемом неравнозначном перекрестке, и при этом ехать по главной дороге, которая не меняет своего направления. В таких случаях вы, обезопасите как себя, так и других участников дорожного движения, увеличив пропускную способность перекрестка.

В некоторых других, похожих ситуациях, разворачиваться сразу за пешеходным переходом, без выезда к центру перекрестка и при активном движении просто опасно. Этот маневр можно выполнять тогда, когда в вашем поле зрения нет приближающихся машин.

Если на дороге организовано одностороннее движение по правую от вас сторону, то разворачиваться при въезде на нее не запрещено. Но обратно выполнить маневр уже нельзя, так как вы будете какое-то время двигаться по встречной полосе.

Также, правилами не запрещен разворот перед шлагбаумом, но это не дает водителям права создавать препятствия и опасные ситуации при таком манёвре. При таком повороте необходимо уступить дорогу тем транспортным средствам, путь которых окажется перекрытым в результате вашего маневра.

Также не запрещен разворот на автомагистрали и дороге для автомобилей, где знаком 5.26 и 5.27 обозначены разрешенные места для этого маневра.

Важно! Выполнять разворот всегда нужно с крайнего левого участка дороги.

Места, где разворот запрещен

В правилах дорожного движения чётко определены места, где манёвр разворота запрещен. Их список является исчерпывающим, и, к сожалению, не содержит в себе конкретные указание, которые разрешают разворот.
Разворот запрещен на железнодорожных переездах, так как места такого рода характеризуются повышенным уровнем опасности, и тут уже ничего не зависит от его ширины, длины и т.д.

Нельзя разворачиваться и при проезде по мостам, эстакадам, путепроводам и под ними. Это обусловлено тем, что в таких местах ограничена возможность маневрирования. Скорость, эстакады, да и узость моста – не лучшее для этого место. Лучше выехать с этого участка, и развернуться в месте, где вы не будете создавать препятствий для другого транспорта.

Следующим, в списке запрещенных мест для разворота, идет туннель. Это всегда ограниченное пространство и низкий уровень освещения, что крайне отрицательно сказываются на любых маневрах водителя (снижается видимость и, соответственно, искажается возможность адекватно расценивать дорожную обстановку). При этом, водитель, несмотря на время суток, при въезде в туннель должен включить ближний свет фар, тем самым отметив себя перед остальными водителям.

Нельзя разворачиваться и в случае, когда видимость на дороге составляет мене 100 м. То есть, в силу особенностей местности, либо погодных условий, трасса может недостаточно освещаться и ограничивать видимость для водителя. Поэтому, для исключения опасных ситуаций, разворот при таком уровне видимости запрещён.

Запрещены развороты на пешеходных перекрестках и на протяжении 10 метров до и после них. Поскольку подобный маневр на перекрестке уже создает опасную ситуацию, как для пешехода, так и для других водителей, разворот в таком месте не разрешается, а исключением является случай, описанный в первом пункте.

Важно! Вы можете подъехать к центру перекрестка. не уступая дорогу встречному транспорту только тогда, когда вы движетесь по главной дороге и вам горит зеленый свет.

Разворот на автомагистрали и дороге для автомобилей – запрещен. Обычно, водители пытаются совершить этот маневр на разрывах разделительной полосы, но и это категорически запрещено, особенно учитывая тот факт, что такие места предназначены для оперативных транспортных средств. Так, в указанных разрывах, при наличии специального удостоверения, могут совершать движение транспортные средства, оборудованные жёлтыми маячками, которые занимаются обслуживанием автомагистрали.

Разворот и светофор

Совершать разворот под регулировку светофора – удобно и, в большинстве случаев, безопасно. Проще всего выполнять маневр на зеленый сигнал светофора или согласно предписаниям стрелки «налево», с зелёным сигналом светофора. При отсутствии встречного транспорта, необходимо доехать до нужного и удобного для вас места, где вы сможете с первого раза сделать разворот, и развернуться.

Знаете ли Вы? Когда вам горит зеленая стрелка «налево», остальным водителям и пешеходам, которые движутся с других направлений – горит красный сигнал.

Если вам получается развернуться в центре перекрестка, но есть встречные автомобили – остановитесь, не доехав до его центра. Только пропустив встречный транспорт, вы можете проехать туда, куда вам нужно, и развернуться.

Когда светиться стрелка «налево» вместе с зеленым или красным сигналом – встречные автомобили должны отсутствовать.

Когда совершаете разворот на зеленый сигнал, следите за задним водителем и за тем, который может поворачивать по дополнительной стрелке «направо».
Часто, именно в таких случаях, случаются аварийные ситуации.

Важно! Старайтесь держать на зрительном контроле поведение водителя машины, которая находится за вами. Он может попытаться сделать поворот налево раньше вас, и, соответственно, столкнется с передним автомобилем.

Разворот и знаки

Еще с курсов вождения, многие водители знают, что есть информационные, предписывающие и запрещающие знаки дорожного движения. Какие знаки разрешают разворот вы, думаю, изучали, но для уверенности предлагаю рассмотреть их еще раз.

Информационные знаки

Информационные знаки, которые разрешают разворот в определенном месте дороги – знак 5.26 «Место для разворота» и знак 5.27 «Зона для разворота». Знак 5.26 «Место для разворота» запрещает поворот налево, в то время как разворот разрешен. Знак 5.27 «Зона для разворота» — обозначение, на котором указывается метраж зоны, в которой водитель сможет сделать разворот. Этот знак запрещает поворот налево.

Предписывающие знаки

К знакам, которые предписывают возможность разворота относятся: знак 4.3 «Движение налево», знак 4.5 «Движение прямо или налево», 4.6 «Движение направо или налево».

Знак 4.3 «Движение налево», в нашем случае, разрешает разворот при повороте налево. Если на дороге две и больше полосы в одном направлении, то этот указатель, по правилам, устанавливается над левой полосой. Также на дороге с разделительной полосой, его можно устанавливать на самой разделительной полосе. В этом случае:

Знак 4.5 «Движение прямо или налево» разрешает двигаться на перекрестке прямо, налево и совершать разворот.

Знак 4.6 «Движение направо или налево» говорит сам за себя, и дает разрешение на движение направо, налево и на разворот.

Запрещающие знаки

Знаков, которые запрещают поворот, достаточно много, но только один из них запрещает именно разворот. Все остальные, запрещают поворот, но разворот, соответственно разрешен, так как и знак «Разворот запрещен» не запрещает поворот. Например, если вы видите знак по которому поворот налево запрещен, то он разрешает разворот.

В большинстве случаев, такой знак устанавливают на перекрестке, где разворот может быть опасным для других транспортных средств и пешеходов. Этот знак, в таком случае, действует на весь перекресток, а не на отдельную его часть. Если на участке ведутся дорожные работы, то этот знак можно увидеть с жёлтым фоном, что обозначает его временность.
Можно ли развернуться вне перекрестка

Водитель, особенно неопытный, часто задается вопросом, разрешен ли разворот вне перекрестка? Ответ на этот вопрос, в принципе, вы можете найти в правилах дорожного движения.

Согласно им, разворот на дороге вне перекрестка, разрешается в том случае, когда нет встречных транспортных средств, а значит, водитель не сможет создать опасную ситуацию.

Также разрешается поворот на трамвайных путях, или разворот через них, но только в случае, если они находятся по левую сторону от водителя, на одном уровне с проезжей частью. Более того, не должно быть знаков, запрещающих совершать этот маневр.

Штрафы за нарушение правил разворота

Если вы нарушили правила разворота на перекрестке, то это вам обойдется в сумму от 425 – 510 грн. В то же время, при выполнении указанного маневра на переезде железнодорожных путей, размер наказания будет находиться в пределах 255 – 340 грн.

Подписывайтесь на наши ленты в таких социальных сетях как,
Facebook,
Вконтакте,
Instagram,
Pinterest,
Yandex Zen,
Twitter и
Telegram:
все самые интересные автомобильные события собранные в одном месте.

Система измерения температуры плазмы с обращенной натриевой линией

. Тематический отчет № 8 (Технический отчет)


Филип Т., Бауман Л. и Бентон Р. Система измерения температуры плазмы с обращением линии натрия. Тематический доклад № 8 . США: Н. П., 1993.
Интернет. DOI: 10,2172 / 10182435.


Филип Т., Бауман Л. и Бентон Р. Система измерения температуры плазмы с обращением натриевой линии. Тематический доклад № 8 . Соединенные Штаты. https://doi.org/10.2172/10182435


Филип Т., Бауман Л. и Бентон Р. Ср.
«Система измерения температуры плазмы с обращением натриевой линии. Тематический отчет № 8». Соединенные Штаты. https://doi.org/10.2172/10182435. https://www.osti.gov/servlets/purl/10182435.

@article {osti_10182435,
title = {Система измерения температуры плазмы с обращением натриевой линии. Тематический доклад № 8},
author = {Филип Т. и Бауман, Л. и Бентон, Р.},
abstractNote = {Система изменения направления натриевой линии - один из передовых оптических диагностических приборов, разработанных DIAL для измерения температуры в условиях горения угля на крупных предприятиях.Принципы работы, описание системы и ее возможностей, а также подробности работы этого инструмента представлены в этом отчете.},
doi = {10.2172 / 10182435},
url = {https://www.osti.gov/biblio/10182435},
журнал = {},
номер =,
объем =,
place = {United States},
год = {1993},
месяц = ​​{9}
}


Ассоциация сроков отмены колостомы с результатами после процедуры Хартмана при дивертикулите | Колоректальная хирургия | JAMA Surgery

Ключевые моменты

Вопрос
Какова связь времени отмены колостомы с послеоперационными исходами у пациентов, перенесших операцию Хартмана по поводу дивертикулита?

Выводы
В этом исследовании с участием 1660 пациентов из государственных стационарных баз данных менее одной трети пациентов подверглись отмене колостомы в течение 1 года после окончания колостомии по поводу дивертикулита.Социально-экономические различия были замечены во времени до отмены колостомии, а более длительная продолжительность пребывания и 90-дневная повторная госпитализация были значительно более вероятными в поздних группах по сравнению с группами ранней отмены.

Значение
Реверсирование колостомы безопасно уже через 45-110 дней после процедуры Хартмана при дивертикулите у отдельных пациентов.

Важность
Процедура Хартмана (конечная колостомия) остается распространенной операцией при дивертикулите, требующей хирургического вмешательства.Однако время последующей отмены колостомы остается в широких пределах, а оптимальное время остается неизвестным.

Объектив
Изучить связь времени отмены колостомы с результатами операции.

Дизайн, обстановка и участники
Этот ретроспективный анализ государственных стационарных баз данных по проекту «Стоимость и использование здравоохранения» для Калифорнии, Флориды и Мэриленда включал пациентов, перенесших колостомию по поводу дивертикулита, связанного с их отменой колостомии.Пациенты с повторной госпитализацией между индексной операцией и обращением были исключены, оставив окончательную когорту из 1660 пациентов. Данные собирались с 1 января 2010 г. по 31 декабря 2016 г. и анализировались с 1 декабря 2017 г. по 31 мая 2018 г.

Экспозиции
Пациенты были разделены на ранние (45-110 дней), средние (111-169 дней) и поздние (≥170 дней) сроки отмены колостомы после индексной операции.

Основные результаты и мероприятия
Первичные результаты, представляющие интерес после отмены, включали смертность, заболеваемость и повторную госпитализацию и сравнивались между всеми группами с использованием логистической регрессии с поправкой на сопутствующие заболевания и возраст.

Результаты
Всего было выявлено 7165 пациентов со сроком наблюдения не менее 1 года, а у 2028 (28,3%) пациентов в течение 1 года произошла реверсия. Из пациентов, у которых была реверсия в течение 1 года, 1660 не были повторно госпитализированы до реверсии (860 мужчин [51,8%]; средний возраст 61 год [межквартильный размах {IQR}, 51-70 лет]). Среднее время до разворота составляло 129 дней (IQR, 99–182 дня). При многомерном анализе характеристики пациентов, связанные с ранним обращением, включали возраст 60 лет и младше (отношение шансов [OR], 1.31; 95% ДИ, 1,00–1,70; P = 0,0497), белая раса (OR, 1,32; 95% ДИ, 1,05–1,67; P = 0,02) и частное страхование против Medicaid (OR, 2,45; 95% ДИ, 1,67-3,60; P <0,001). Смертность, переливание крови, кишечная непроходимость и серьезные осложнения существенно не различались между группами по времени отмены. Однако увеличенная продолжительность пребывания в стационаре (OR 1,62; 95% CI 1,19-2,21; P = 0,002) и 90-дневная повторная госпитализация (OR 1,61; 95% CI 1,18-2,22; P = 0,003 ) были значительно более вероятными в группах позднего и раннего выбора времени.

Выводы и значимость
Менее одной трети пациентов подвергаются отмене колостомии в течение 1 года после окончания колостомии по поводу дивертикулита, а время отмены связано с социально-экономическими различиями. У отдельных пациентов с неосложненным курсом лечения улучшенные результаты связаны с более ранней отменой, а отмена колостомы безопасна уже через 45–110 дней после первоначальной процедуры.

Острый дивертикулит является серьезным бременем для здравоохранения в Соединенных Штатах, на него ежегодно приходится более 300 000 госпитализаций. ¹ Хотя многие пациенты успешно проходят консервативное лечение, небольшая часть пациентов потребует хирургического вмешательства из-за резистентного с медицинской точки зрения или агрессивного заболевания. ^{2 , 3} Пациенты, которым требуется операция по поводу дивертикулита, часто подвергаются процедуре Хартмана, которая влечет за собой создание концевой колостомы. ^{1 , 4} Эта процедура может спасти жизнь, но пациенты сталкиваются с проблемами, связанными с выполнением конечной колостомы, и, таким образом, раннее восстановление непрерывности кишечника является последующим приоритетом для многих пациентов. ⁵

Выбор времени для отмены колостомы в значительной степени определяется хирургом, и обычная практика включает ожидание периода в несколько месяцев перед отменой колостомы, чтобы позволить послеоперационному воспалению утихнуть и смягчить сложные повторные операции из-за внутрибрюшных спаек. ^{5 -9} Учитывая отсутствие руководящих указаний, время разворота сильно варьируется. Несколько небольших институциональных исследований ^{6 -10} дали противоречивые результаты с выводами в пользу отмены через 3 месяца, через 4 месяца, через 6 месяцев, до 4 месяцев и до 9 месяцев.

Оптимальное время для отмены колостомы неизвестно, и его трудно было изучить из-за невозможности отслеживать пациентов по госпитализации и по годам в больших базах данных. Эта ситуация ограничила изучение результатов у независимых пациентов, перенесших несколько процедур в течение нескольких лет. Однако государственные стационарные базы данных Проекта затрат и использования здравоохранения (HCUP) стали важным инструментом для отслеживания пациентов в нескольких госпитализациях в течение нескольких лет.Таким образом, государственные базы данных были использованы для исследования связи времени отмены колостомы после дивертикулита с оперативными исходами и характеристиками пациентов. Мы предположили, что раннее обращение не отличается от более позднего обращения с точки зрения смертности и осложнений.

Это исследование было ретроспективным исследованием государственных баз данных стационарных пациентов HCUP. Это исследование было одобрено исследовательским советом Йельского университета, Нью-Хейвен, Коннектикут, который отказался от необходимости получать информированное согласие на использование деидентифицированных данных пациентов.

Quiz Ref ID Государственные стационарные базы данных для Калифорнии (с 1 января 2010 г. по 31 декабря 2012 г.), Флориды (с 1 января 2013 г. по 31 декабря 2016 г.) и Мэриленда (с 1 января 2013 г. по 31 декабря 2015 г.) были объединены в этом анализе. Не во всех штатах есть переменные, позволяющие связывать пациентов между поступлениями. Поэтому Калифорния, Флорида и Мэриленд были выбраны как штаты с географически, социально-экономическим и региональным разнообразием представительства, большой численностью населения и доступными необходимыми переменными.Кроме того, государственные стационарные базы данных позволяют отслеживать пациентов от операции индексации до всех последующих повторных госпитализаций в каждом штате. Самые последние доступные годы были получены для каждого штата. Государственные стационарные базы данных курируются Агентством по исследованиям и качеству здравоохранения, и этот проект был проведен с их одобрения.

Государственные стационарные базы данных HCUP включают информацию о демографических характеристиках пациентов (возраст, пол, раса, страхование и т. Д.) И о госпитализации ( Международная классификация болезней, девятая редакция, клиническая модификация [ ICD-9-CM ], коды для ≤ 25 диагнозов и процедур, продолжительность пребывания [LOS], смерть в больнице и т. Д.).Раса — это переменная, собранная HCUP, и она была включена в это исследование в качестве переменной для устранения обнаруженных ранее различий в реверсировании колостомы. ^{11 , 12} Основными исходами, представляющими интерес в этом исследовании после отмены колостомии, были смертность, госпитальная LOS, переливание крови, кишечная непроходимость, серьезные осложнения и повторная госпитализация через 90 дней. Основные осложнения были присвоены диагностическим кодам ICD-9-CM , как было продемонстрировано ранее ¹³ , и включали внутрибрюшной абсцесс, несостоятельность анастомоза, сепсис, пневмонию, легочную недостаточность, инфаркт миокарда, венозную тромбоэмболию, острую почечную недостаточность, послеоперационное кровотечение, и кровотечение из желудочно-кишечного тракта.Длительная LOS была определена как LOS в верхнем квартиле для реверсирования колостомы (> 7 дней).

Пациенты с колостомией ( МКБ-9-CM коды 46.10, 46.11 и 46.13) для диагностики дивертикулита ( МКБ-9-CM код 562.11) были связаны с их обращением колостомы ( коды МКБ-9-CM 46,50 и 46,52). Чтобы описать долю пациентов с периодом наблюдения не менее 1 года, у которых произошла реверсия в течение 1 года, была отобрана описательная когорта пациентов, перенесших индексную операцию более чем за 1 год до окончания сбора данных в каждом штате (n = 7165). ).Для сравнения исходов пациентов, которым была сделана реверсия, прогностическая когорта включала всех, кто прошел процедуру, независимо от времени наблюдения (n = 3711). Чтобы выбрать только тех пациентов, у которых не было осложнений в результате их процедуры индексации, пациенты, которые были повторно госпитализированы между операцией индексации и реверсированием, были исключены. Пациенты, перенесшие реверсию через 365 дней, также были исключены для окончательной прогностической когорты из 1660 пациентов.

Чтобы оценить связь времени с исходами, время до отмены было разделено на ранние, средние и поздние категории.Идентификационный номер викторины В отсутствие каких-либо официально принятых руководящих принципов, эти категории были выбраны статистически терцильной группой, чтобы оставаться беспристрастными и описывать всю широту практики. Ранний разворот был определен от 45 до 110 дней; средний разворот, от 111 до 169 дней; и поздний разворот — от 170 до 360 дней. Учитывая, что менее чем у 1% людей произошла реверсия до 45 дней, эти люди были исключены как выбросы. Для прямого сравнения более ранних и более поздних групп разворота было проведено 2 анализа чувствительности для разворотов до 90 дней и до 60 дней по сравнению с более поздним разворотом.

Данные были проанализированы с 1 декабря 2017 г. по 31 мая 2018 г. Результаты сравнивались среди всех групп с использованием логистической регрессии с поправкой на индекс коморбидности Чарлсона и возраст. Чтобы определить характеристики пациента, связанные со сроками обращения, был проведен дополнительный многомерный логистический регрессионный анализ с поправкой на возраст, пол, расу, сопутствующие заболевания и страховой статус. Двусторонний P <0,05 считался статистически значимым.Анализ проводился с использованием программного обеспечения SAS (версия 9.4; SAS Institute Inc).

Сроки обращения и характеристики пациента

В общей сложности было выявлено 7165 пациентов с периодом наблюдения не менее 1 года, и у 2028 (28,3%) наблюдалось реверсирование в течение 1 года. В общей сложности мы идентифицировали 1660 пациентов (прогностическая когорта), у которых произошла реверсия в течение 365 дней и у них был неосложненный послеоперационный период (т.е. без повторных госпитализаций между индексной хирургией и реверсией) (среди тех, у кого есть данные, 860 мужчин [51.8%] и 773 [46,6%] женщин; средний возраст 61 год [межквартильный размах 51–70 лет]). Среднее время разворота составляло 129 дней (межквартильный диапазон, 99–182 дня), хотя наиболее распространенный период (режим) разворота составлял от 90 до 100 дней (рисунок). Одномерный анализ показал, что люди с меньшей вероятностью подвергнуться раннему обращению (по сравнению со средним и поздним обращением) были старше (возраст> 76 лет, 48 из 561 [8,6%] против 78 из 582 [13,4%] против 72 из 501 [14,4%]) ), были небелыми (84 из 561 [15,0%] против 117 из 582 [20.1%] против 112 из 501 [22,4%]), имели больше сопутствующих заболеваний (11 из 561 [2,0%] против <10 против 19 из 501 [3,8%]) и были недостаточно застрахованы (частное страхование, 308 из 561 [54,9%] ] против 273 из 582 [46,9%] против 172 из 501 [34,3%]) (Таблица 1). Ссылка на тест ID В многофакторном анализе характеристики пациентов, независимо связанные с ранним обращением, включали возраст 60 лет и младше (отношение шансов [OR], 1,31 95% ДИ, 1,00–1,70; P = 0,0497), представители белой расы (OR, 1,32; 95% ДИ 1,05–1,67; P = 0,02), а также частное страхование по сравнению с Medicaid (OR, 2.45; 95% ДИ 1,67-3,60; P <0,001) (Таблица 2).

Время разворота и результаты

При однофакторном анализе необходимость переливания крови (36 из 561 [6,4%] против 49 из 501 [9,8%]; P = 0,04), серьезные осложнения (67 из 561 [11,9%] против 86 из 501 [ 17,2%]; P = 0,02), 90-дневная реадмиссия (87 из 561 [15.5%] против 121 из 501 [24,2%]; P <0,01), а длительный LOS (93 из 561 [16,6%] против 136 из 501 [27,1%]; P <0,01) были более распространены в поздних группах по сравнению с группами раннего обращения (Таблица 3 ). После корректировки на возраст пациента и сопутствующие заболевания не было значительных различий в госпитальной 90-дневной смертности, переливании крови, кишечной непроходимости и серьезных осложнениях (таблица 4). Quiz Ref ID Однако продленная LOS (OR, 1,62; 95% CI, 1,19-2,21; P = 0,002) и повторная госпитализация на 90 дней (OR, 1.61; 95% ДИ 1,18-2,22; P = 0,003) были значительно более вероятными в группах позднего и раннего обращения (таблица 4).

Мы сравнили пациентов с реверсией ранее, чем через 90 дней (249 пациентов), напрямую с пациентами с более поздней реверсией. Это сравнение (таблица 1 в Приложении) не показало разницы в 90-дневной смертности в больнице, переливании крови, кишечной непроходимости, серьезных осложнениях и длительном LOS, но показало, что реверсирование до 90 дней было связано со значительным снижением вероятности 90-дневной повторной госпитализации (ИЛИ , 0.57; 95% ДИ 0,36-0,83; P = 0,005) по сравнению с более поздним разворотом.

Кроме того, мы сравнили пациентов с реверсией ранее, чем через 60 дней (44 пациента), напрямую с пациентами с более поздней реверсией. Частота наблюдаемых осложнений была ниже у пациентов, перенесших лечение в течение 60 дней, по сравнению с более поздним лечением, хотя это не было значительным различием (таблица 2 в Приложении). Мы не обнаружили существенных различий в госпитальной 90-дневной смертности, переливании крови, кишечной непроходимости, серьезных осложнениях, длительной LOS и 90-дневной повторной госпитализации между этими группами.

После колостомии по поводу дивертикулита раннее выздоровление является приоритетом для многих пациентов; однако мало что известно о связи времени разворота и исходов. Это исследование с участием 1660 отобранных пациентов с неосложненными курсами лечения после выписки демонстрирует, что смертность и осложнения были схожими между периодами восстановления в течение 1 года, но что более раннее обращение было связано со снижением LOS и меньшим количеством повторных госпитализаций. Quiz Ref ID Эти данные свидетельствуют о том, что отмена колостомы уже через 45–110 дней безопасна для отдельных пациентов с неосложненным курсом лечения.Предыдущие исследования, посвященные этому вопросу, дали противоречивые результаты, вероятно, из-за небольших групп, изученных в избранных учреждениях, и трудностей в наблюдении за пациентами после индексной операции. ⁵ Например, Roe et al. ⁷ ретроспективно разделили 69 пациентов между теми, у кого была реверсия до и после 4 месяцев, и рекомендовали раннюю реверсию после обнаружения осложнений в 24% ранних и 35% поздних реверсий. Pearce et al. ⁶ проанализировали 80 пациентов и пришли к выводу, что обратимость лечения была более безопасной через 6 месяцев, обнаружив 3 смерти и 4 септических осложнения у пациентов до 6 месяцев и ни одного — через 6 месяцев.Fleming и Gillen ⁸ обследовали 110 пациентов и рекомендовали отмену лечения до 9 месяцев, показывая аналогичные осложнения у пациентов, перенесших лечение до и после этого периода времени. Для сравнения, наше исследование смогло связать гораздо большее количество пациентов, перенесших колостомию по поводу дивертикулита, с их отменой колостомии, используя Государственные базы данных стационарных пациентов HCUP, и отслеживать пациентов во многих учреждениях в течение нескольких лет.

Анализ подгрупп пациентов, перенесших обратный ход до 90 дней и до 60 дней, показывает частоту осложнений, аналогичную таковой в более поздних группах реверсирования, и предполагает, что отобранным пациентам с неосложненным течением, возможно, не нужно ждать произвольные 3 месяца для отмены.Хотя эти результаты обнадеживают, меньшее количество пациентов подверглось реверсии до 90 дней (n = 249) и 60 дней (n = 44), поэтому нельзя полагаться на эти данные для доказательства неполноценности; Для подтверждения этих результатов необходимы дополнительные исследования.

Это исследование также демонстрирует, что колостома чрезвычайно редко восстанавливается раньше, чем через 45 дней после дивертикулита (<1%). Распределение времени до отмены колостомы в этом исследовании было аналогично таковому в других исследованиях, оценивающих закрытие стомы, даже включая временные илеостомии и резекции рака. ^{13 -16} Интересно, что небольшие исследования отклоняющих илеостомий показали, что у пациентов может произойти реверсирование уже через 8 дней после операции на индексе, и что более раннее обращение может быть связано с экономией затрат. ^{17 , 18} Напротив, реверсирование конечной колостомы после дивертикулита более болезненно, чем реверсирование отводящей илеостомы, ^{5 , 19} , и это исследование подтверждает, что очень немногие хирурги пытаются закрыть колостомию раньше, чем через 45 дней.Тем не менее, это исследование демонстрирует, что, хотя реверсирование колостомы кажется безопасным для пациентов с неосложненным курсом менее 90 дней после индексной операции, большинство пациентов будут ждать более 130 дней, чтобы реверсировать колостому. Дальнейшее исследование должно быть сосредоточено на препятствиях, препятствующих своевременной отмене колостомы у этих подходящих кандидатов несложным курсом.

Это исследование также предполагает, что дополнительные факторы определяют, получит ли пациент раннюю отмену колостомы, что может не иметь медицинского характера.Интересно, что среди этой группы пациентов с неосложненным течением индекс коморбидности Чарлсона не был независимо связан со сроками обращения, но возраст был очень значимым. Этот результат согласуется с результатами предыдущего исследования ²⁰ , но противоречит другим исследованиям, которые обнаружили сопутствующую патологию как важную причину, по которой конечные колостомы не были отменены. ^{21 , 22} Однако в настоящем исследовании анализировались только пациенты, у которых действительно произошла реверсия в течение 1 года.Таким образом, эта группа была выбрана хирургом как подходящая кандидатура для реверсирования. Поскольку маловероятно, что сопутствующие заболевания у пациента изменится в течение 1 года и сделают их более подходящим кандидатом через произвольное количество месяцев, неудивительно, что индекс коморбидности Чарлсона не был независимо связан со сроком обращения вспять в этом исследовании.

Как неожиданный результат, у статуса страхования была самая сильная независимая связь с ранним обращением, а расовая принадлежность также имела независимую связь.Предыдущие исследования также по-разному выявляли социально-экономические различия в частоте и сроках закрытия стомы. ^{20 , 21} Зафар и др. ¹¹ обнаружили более низкие показатели реверсии стомы у чернокожих по сравнению с белыми пациентами, но не отслеживали отдельных пациентов и вместо этого сравнивали национальные показатели образования стомы с показателями закрытия. В качестве альтернативы, Gunnells et al. ¹² не обнаружили расовых различий в исследовании, проведенном в одном учреждении в течение 1 года, но обнаружили сильное неравенство на основе страхования.Результаты настоящего исследования, вероятно, более репрезентативны для социально-экономического неравенства, учитывая размер выборки и возможность отслеживать пациентов в разных учреждениях в пределах штата.

Наконец, это исследование продемонстрировало низкую общую частоту отмены колостомы в течение 1 года после дивертикулита (28,3%). Предыдущие исследования продемонстрировали частоту отмены конечной колостомии с 35% до 69%, ^{8 , 13 , 15 , 20 , 22} , но большинство исследований включали смешанные группы пациентов, которые могли подвергнуться переадресации. при дивертикулите, раке и других показаниях.Доля пациентов, перенесших реверсию в настоящем исследовании, вероятно, является консервативной оценкой, потому что умершие пациенты не были исключены из этой доли, а пациенты, которые перемещались из одного штата в другой, не будут включены. Предыдущие исследования показали, что основной причиной необратимости является смерть, и эти пациенты были исключены из многих предыдущих анализов. ^{10 , 15} Лица, умершие в период между индексной операцией и 1 годом, не были исключены из этого анализа, поскольку данные о смерти пациентов не имеют надежной связи с этой базой данных, если только пациент не умер во время пребывания в стационаре.Этот метод, вероятно, приведет к заниженной оценке в этом исследовании по сравнению с другими анализами.

Это исследование включает несколько ограничений, присущих ретроспективному обзору административных баз данных. Например, мы не можем установить хирургическую сложность индексной процедуры Хартмана, классификацию дивертикулита Хинчи или хирургические параметры, связанные с закрытием, такие как время операции. Кроме того, предвзятость хирурга может сыграть роль в определении того, когда следует отменить колостому, и хирурги, которые выполняют более поздние отмены, также могут быть теми же консервативными хирургами, которые удерживают пациентов в госпитализации дольше и вызывают увеличение LOS.Кроме того, мы можем только изучить то, что уже делают хирурги. Интересный последующий вопрос к этому исследованию: каковы исходы у лиц, перенесших обратное лечение ранее, чем через 45 дней после операции на индексе, и связаны ли выборка тяжести спаек или сложности случая с успехом раннего восстановления. Однако эти данные не могут ответить на этот вопрос, потому что очень немногие хирурги пытаются это сделать.

Менее одной трети пациентов подвергаются отмене колостомии в течение 1 года после окончания колостомии по поводу дивертикулита, а время отмены связано с социально-экономическими различиями.У отдельных пациентов с неосложненным курсом лечения улучшенные результаты связаны с более ранней отменой, а восстановление колостомы безопасно уже через 45–110 дней после процедуры индексации.

Принято к публикации: 1 сентября 2018 г.

Автор для корреспонденции: Кевин Ю. Пей, доктор медицины, отделение хирургии, Йельская медицинская школа, 330 Cedar St, Room 310, Boardman Building, New Haven, CT 06519 ([email protected]).

Опубликовано в Интернете: 21 ноября 2018 г. doi: 10.1001 / jamasurg.2018.4359

Вклад авторов : Доктора Ресио и Пей имели полный доступ ко всем данным в исследовании и несут ответственность за целостность данные и точность анализа данных.

Концепция и дизайн: Все авторы.

Сбор, анализ или интерпретация данных: Все авторы.

Составление рукописи: Resio, Pei.

Критический пересмотр рукописи на предмет важного интеллектуального содержания: Все авторы.

Статистический анализ: Resio, Jean, Chiu.

Административная, техническая или материальная поддержка: Жан.

Надзор: Пей.

Раскрытие информации о конфликте интересов: Не сообщалось.

Встреча Презентация: Этот документ был представлен на Ежегодном собрании Ассоциации хирургов по делам ветеранов в 2018 г .; 7 мая 2018 г .; Майами, Флорида.

3.Сточки
L. Текущие показания и роль хирургии в лечении дивертикулита сигмовидной кишки. Мир Дж. Гастроэнтерол . 2010; 16 (7): 804-817.PubMedGoogle Scholar9.Keck
JO, Коллопи
BT, Райан
Пи Джей, Финк
Р, Маккей
JR, Вудс
RJ. Отмена процедуры Хартмана: влияние времени и техники на легкость и безопасность. Диск прямой кишки . 1994; 37 (3): 243-248. DOI: 10.1007 / BF02048162PubMedGoogle ScholarCrossref 10.Хан
AL, Ah-See
АК, Крофтс
TJ, Привет
С.Д., Еремин
О. Отмена колостомы Хартмана. J R Coll Surg Edinb . 1994; 39 (4): 239-242.PubMedGoogle Scholar12.Gunnells
Диджей, дерево
LN, Госс
L,
и другие. Расовые различия после строительства стомы существуют во времени до закрытия через 1 год, но не в общих показателях реверсии стомы. Дж Гастроинтест Сург . 2018; 22 (2): 250-258. DOI: 10.1007 / s11605-017-3514-yPubMedGoogle Scholar16.Herrle
F, Сандра-Петреску
F, Вайс
C, сообщение
S, Рункель
N, Kienle
P. Качество жизни и время закрытия стомы у пациентов с раком прямой кишки, перенесших низкую переднюю резекцию с отклоняющейся стомой: многоцентровое продольное обсервационное исследование. Диск прямой кишки . 2016; 59 (4): 281-290. DOI: 10.1097 / DCR.0000000000000545PubMedGoogle ScholarCrossref 18.Альвы
А, Панис
Y, Лелонг
B, Дуссе
B, Бенуа
S, Викаут
Э.Рандомизированное клиническое исследование раннего и отсроченного временного закрытия стомы после проктэктомии. Br J Surg . 2008; 95 (6): 693-698. DOI: 10.1002 / bjs.6212PubMedGoogle ScholarCrossref 19. Хан
С, Алви
R, Awan
Z, Харун
N. Заболеваемость отменой колостомы. Дж. Пак Мед Ассо . 2016; 66 (9): 1081-1083.PubMedGoogle Scholar

Обратный эффект и его механизмы тетраметилпиразина на множественную лекарственную устойчивость при раке мочевого пузыря человека

Abstract

Химиотерапия — важная стратегия лечения рака мочевого пузыря.Однако основная проблема, ограничивающая успех химиотерапии, — это развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Чтобы улучшить лечение рака мочевого пузыря, необходимо срочно поискать стратегии по обращению вспять МЛУ. Мы выбрали три вида лекарственных трав, включая гинсенозид Rh3, (-) — галлат эпигаллокатехина (EGCG) и тетраметилпиразин (TMP), чтобы обнаружить их влияние на рак мочевого пузыря. Обратные эффекты этих трех лекарственных трав на лекарственную устойчивость в устойчивых к адриамицину (ADM) клетках Pumc-91 (Pumc-91 / ADM) оценивали с помощью системы анализа пролиферации клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8).Механизмы обратного действия TMP были исследованы на клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP. После обработки клеток Pumc-91 / ADM и T24 / DDP TMP анализ распределения клеточного цикла выполняли с помощью проточной цитометрии. Экспрессию MRP1, GST, BCL-2, LRP и TOPO-II оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR), иммунофлуоресцентного анализа и вестерн-блоттинга. Было замечено, что TMP был способен повышать цитотоксичность противораковых агентов на клетках Pumc-91 / ADM в ответ на ADM, однако Rh3 и EGCG не могли этого сделать.Обратный эффект TMP был также продемонстрирован в клетках T24 / DDP. Более того, обработка TMP в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP приводила к усилению фазы G1, сопровождаемому одновременным уменьшением количества клеток в S-фазе. По сравнению с контрольной группой, очевидное снижение MRP1, GST, BCL-2 и увеличение TOPO-II было показано в группах TMP с зависимостью от дозы уровней мРНК и белка. Однако не было различий в экспрессии LRP между группами TMP и контрольной группой. TMP может эффективно обратить вспять MDR клеток Pumc-91 / ADM и T24 / DDP, и его механизмы могут быть коррелированы с изменением MRP1, GST, BCL-2 и TOPO-II.ТМП может быть потенциальным кандидатом для изменения лекарственной устойчивости при химиотерапии рака мочевого пузыря.

Образец цитирования: Wang S, Lei T, Zhang M (2016) Обратный эффект и его механизмы действия тетраметилпиразина на множественную лекарственную устойчивость при раке мочевого пузыря человека. PLoS ONE 11 (7):
e0157759.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759

Редактор: Ференц Галляс-младший, Медицинская школа Университета Печ, ВЕНГРИЯ

Поступила: 14 февраля 2016 г .; Одобрена: 3 июня 2016 г .; Опубликован: 8 июля 2016 г.

Авторские права: © 2016 Wang et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Это исследование финансировалось Пекинским управлением традиционной китайской медицины (2014-ZYJ04) и Пекинской ключевой лабораторией молекулярной диагностики мочевых клеток (Z151100001615060).Ман Чжан получил финансирование. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Во всем мире рак мочевого пузыря является наиболее распространенным раком мочеполовых путей у мужчин [1]. Примерно 70% раковых заболеваний представляют собой неинвазивные опухоли с высокой степенью рецидива, в то время как остальные 30% являются инвазивными в мышцах с высоким риском смерти от отдаленных метастазов [2].Трансуретральная резекция опухоли мочевого пузыря (ТУР мочевого пузыря) необходима для немышечно-инвазивного лечения рака мочевого пузыря. В отношении опухоли Ta ​​и T1 низкой степени злокачественности необходима внутрипузырная химиотерапия или иммунотерапия. При мышечно-инвазивном раке мочевого пузыря стандартной операцией является радикальная цистэктомия и рассечение лимфатических узлов [3]. Системная химиотерапия является разумной альтернативой после операции для пациентов с мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря. Недавние исследования показывают, что хирургическое вмешательство в сочетании с химиотерапией может улучшить качество жизни и увеличить выживаемость [4].Однако раковые клетки часто развивают почти сверхъестественную способность противостоять воздействию химиотерапевтических агентов против рака. Отбор раковых клеток одним химиотерапевтическим препаратом обычно приводит к перекрестной устойчивости к другим препаратам с другими клеточными мишенями и структурами. Это явление известно как множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) [5]. Развитие множественной лекарственной устойчивости в раковых клетках мочевого пузыря может серьезно повлиять на эффективность системной химиотерапии рака [6]. Адриамицин и цисплатин — важные препараты, используемые в химиотерапии против рака мочевого пузыря.Однако из-за развития МЛУ лечение рака мочевого пузыря адриамицином, цисплатином или другими агентами часто оказывается безуспешным. Приобретение МЛУ может быть опосредовано многими механизмами, включая увеличение оттока лекарственного средства, снижение притока лекарственного средства, инактивацию лекарственного средства и изменения в мишени лекарственного средства, модификацию контрольных точек клеточного цикла и усиление репарации повреждений ДНК и дефектные пути апоптоза [7– 9].

Некоторые белки МЛУ участвуют в лекарственной устойчивости рака мочевого пузыря за счет снижения внутриклеточных концентраций лекарственного средства.Эти белки могут предсказывать плохие результаты после химиотерапии [10–12]. При раке мочевого пузыря экспрессия мРНК MDR1 в рецидивирующих и остаточных опухолях после химиотерапии доксорубицином была выше, чем в необработанных первичных опухолях [13]. Белок 1 множественной лекарственной устойчивости и белок, связанный с устойчивостью легких, были сверхэкспрессированы при местнораспространенном раке мочевого пузыря. Экспрессия MRP1 коррелировала с более высоким ответом и более высокой вероятностью сохранения мочевого пузыря после неоадъювантной химиотерапии [14]. Высокая экспрессия LRP была значительно связана с худшим ответом на неоадъювантную химиотерапию и снижением вероятности сохранения мочевого пузыря [14].

Сообщается о том, что многие модуляторы множественной лекарственной устойчивости вносят свой вклад в развитие МЛУ. Однако из-за наличия нескольких препятствий они ограничивали терапевтическую эффективность в клинике. Одной из частых причин клинической неэффективности модуляторов МЛУ является их неспецифическая токсичность для онкологических больных. Другим препятствием является неожиданное и нежелательное фармакокинетическое взаимодействие между модуляторами и противораковыми препаратами, используемыми для лечения пациентов, что приводит к снижению доз противоопухолевых препаратов и, таким образом, неэффективному эффекту [15].Следовательно, крайне необходимо найти новые медиаторы МЛУ, которые могут эффективно обратить вспять лекарственную устойчивость, чтобы удовлетворить потребность в химиотерапии.

Rh3 (Рис. 1a), гинзенозид с даммарановым скелетом, как было показано, подавляет рост и индуцирует апоптоз in vitro во многих раковых клетках [16–18]. Зеленый чай, полученный из растения Camellia sinensis, является одним из наиболее распространенных напитков, потребляемых во всем мире, особенно в Китае. Основными катехинами зеленого чая являются (-) — эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG) (рис. 1b), на долю которого приходится 50–80% катехинов в зеленом чае.Сообщалось, что EGCG обладает ингибирующей активностью против туморогенеза [19,20]. Тетраметилпиразин (рис. 1c) является одним из основных биологически активных компонентов Chuanxiong. Было подтверждено, что TMP способен обратить вспять MDR клеток BEL-7402 / ADM в ответ на ADM [21]. Но до сих пор не было исследований по изменению лекарственной устойчивости Rh3, EGCG и TMP при химиотерапии рака мочевого пузыря.

В этом исследовании эффекты Rh3, EGCG и TMP на жизнеспособность клеток были обнаружены в линии клеток рака мочевого пузыря человека с множественной лекарственной устойчивостью Pumc-91 / ADM.Также были выполнены обратные эффекты этих трех лекарственных трав. Более того, механизмы обратного действия TMP на MDR были изучены на клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP.

Материалы и методы

Культура клеток

Клеточная линия рака мочевого пузыря человека Pumc-91 была предоставлена ​​клеточной лабораторией больницы Пекинского унионного медицинского колледжа. Pumc-91 / ADM представляла собой лекарственно-устойчивую клеточную линию, которая была создана путем поэтапного воздействия на клетки Pumc-91 возрастающих концентраций адриамицина (аладдин, Китай) в диапазоне от 0.От 02 мкг / мл до 1,00 мкг / мл более 6 месяцев. Линия клеток рака мочевого пузыря человека Т24 была предоставлена ​​Коллекцией культур Китайской академии наук. Клеточная линия T24 / DDP рака мочевого пузыря, устойчивого к лекарственным средствам человека, была создана путем поэтапного воздействия на клетки T24 возрастающих концентраций цисплатина (сигма) в диапазоне от 0,01 мкг / мл до 0,60 мкг / мл в течение более 6 месяцев. Характеристики устойчивости к лекарствам клеточных линий Pumc-91 / ADM и T24 / DDP были подтверждены методом МТТ (3- [4, 5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолий бромид), полимеразной цепью обратной транскрипции. реакция (RT-PCR) и проточная цитометрия в предыдущих исследованиях [22,23].Исходную клеточную линию культивировали в среде RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen), которая была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (Dingguo, Biotechnology), в то время как устойчивые к лекарствам линии клеток культивировали в вышеупомянутой среде с 18 % фетальная бычья сыворотка. Клетки инкубировали при 37 ° C в стандартном инкубаторе для клеток с 5% CO ₂ с увлажненной атмосферой, состоящей из 95% воздуха. Все эксперименты проводились, пока клетки находились в фазе экспоненциального роста.

Анализ жизнеспособности клеток

Эффекты Rh3, EGCG и TMP на жизнеспособность клеток Pumc-91 / ADM измеряли с использованием системы анализа пролиферации клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (dojindo).Клетки Pumc-91 / ADM высевали на 96-луночные планшеты с плотностью 8 × 10 ³ клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки инкубировали с различными концентрациями Rh3 (0–100 мкМ) (Sigma-Aldrich), EGCG (0–200 мкМ) (Sigma-Aldrich) и TMP (0–32 мМ) (Sigma-Aldrich). Rh3 и EGCG растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации менее 0,1%, а ТМФ растворяли в метиловом спирте до конечной концентрации менее 0,1%. ДМСО и метиловый спирт в конечной концентрации менее 0.1% не влияет на жизнеспособность клеток. Культуральная среда RPMI-1640 без клеток служила в качестве контроля носителя, а культуральная среда RPMI-1640 с клетками служила в качестве отрицательного контроля. Цитотоксичность этих трех традиционных китайских лекарств была измерена с помощью анализа CCK-8. После обработки клеток Rh3, EGCG и TMP в течение 24 часов, 48 часов и 72 часов в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8. Поглощение измеряли при длине волны 450 нм и 655 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов (модель 680, BioRad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США) после инкубации клеток в течение 2 часов при 37 ° C.Коэффициент пролиферации рассчитывали с использованием следующего уравнения: коэффициент пролиферации (%) = (OD _{в группе, обработанной лекарственным средством} -OD _{, в контрольной группе} ) / (OD _{в контрольной группе} -OD _{, в группе носителя} ). Половинную максимальную ингибирующую концентрацию (IC ₅₀ ) определяли как концентрацию лекарственного средства, которая приводила к 50% ингибированию роста клеток. IC ₅₀ был получен посредством регрессионного анализа между концентрациями лекарственного средства и скоростью ингибирования клеток с использованием SPSS 17.0 программное обеспечение. Все эксперименты повторяли трижды.

Анализ обратимости множественной лекарственной устойчивости

Обратный эффект Rh3, EGCG и TMP на клетки Pumc-91 / ADM был дополнительно обнаружен с помощью CCK-8. Чтобы минимизировать влияние самих Rh3, EGCG и TMP на рост клеток, мы выбрали более низкие их концентрации в экспериментах по обращению. Клетки перед посевом в 96-луночные планшеты и затем обрабатывали различными концентрациями ADM в присутствии Rh3 (0, 5, 10, 20 мкМ), EGCG (0, 10, 20, 40 мкМ) и TMP (0, 1 , 2, 4 мМ) в течение 48 ч соответственно.Клетки, обработанные без лечения травами, считались контрольной группой. Между тем обратный эффект TMP на клетки T24 / DDP был дополнительно обнаружен с помощью CCK-8. Как описано выше, в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8. После инкубирования клеток при 37 ° C в течение 2 часов оптическую плотность регистрировали при длине волны 450 нм и 655 нм.

Значения обратной кратности (RF) в качестве параметра эффективности рассчитывали путем деления IC ₅₀ одного ADM на IC ₅₀ ADM в комбинации с Rh3, EGCG или TMP в клетках Pumc-91 / ADM.RF TMP в клетках T24 / DDP рассчитывали путем деления IC ₅₀ одного DDP на IC ₅₀ DDP в комбинации с TMP. Комбинационный индекс (CI) рассчитывался по формуле: CI = (Ea + b) / (Ea + Eb-Ea × Eb) [24]. В формуле Ea + b представляет степень ингибирования ADM в комбинации с Rh3, EGCG, TMP или DDP в комбинации с TMP. Ea представляет собой индивидуальную степень ингибирования Rh3, EGCG или TMP, а Eb представляет собой степень ингибирования ADM или DDP. Характер лекарственного взаимодействия определяли как: i) добавка (+), если CI находился в диапазоне от 0.От 85 до 1,15; ii) синергизм (++), если CI находится в диапазоне от 1,15 до 2,0; iii) вычитание (-), если CI составляло от 0,85 до 0,55, и iv) антагонизм (-), если CI был <0,55.

Анализ распределения клеточного цикла

Клетки Pumc-91 / ADM и T24 / DDP помещали в чашки для культивирования при концентрациях, определенных для достижения 50-60% слияния в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями TMP (0, 2 и 4 мМ) в течение 48 часов. После этого клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером Дульбекко (D-PBS) (Invitrogen), а затем центрифугировали при 140 g в течение 5 мин.Осадки фиксировали 70% этанолом в D-PBS и хранили при 4 ° C в течение 1 часа. Затем клетки промывали D-PBS и ресуспендировали в растворе йодида пропидия (0,01 мг / мл) (Sigma-Aldrich), содержащем РНКазу (100 мкг / мл). После этого клетки инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем содержание ДНК анализировали с использованием проточного цитометра FACSCalibur с программным обеспечением CellQuest (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения modfit.

qRT-PCR

Тотальную РНК выделяли тризольным реагентом (Ambition, life technologies, США) из клеток Pumc-91 / ADM и T24 / DDP, которые обрабатывали TMP (0, 2 мМ и 4 мМ) в соответствии с инструкциями производителя.кДНК генерировали с использованием Oligo d (T) (Dingguo Biotech), dNTP (Genview) под действием обратной транскриптазы M-MLV (Promega). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием TransStart Top Green qPCR SuperMix (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd) с системой LightCycler 480 Real Time PCR System. Используемые последовательности праймеров для ПЦР были следующими: GAPDH прямой: 5’-TTTGGTATCGTGGAAGGACT-3 ’и обратный: 5’-AGTAGAGGCAGGGATGATGT-3’; MRP1 вперед: 5’-TTGCCGTCTACGTGACCATT-3 ’и назад: 5’-AGGCGTTTGAGGGAGACACT-3’; LRP вперед: 5’-TATGTGCCATCTGCCAAA GT-3 ’и назад: 5’-CATGTAGGTGCTTCCAATCA-3’; GST вперед: 5’-TTCCTGTGCATAATGTGAT-3 ’и назад: 5’-CTGATTCAA AGGCAAATCTC-3’; TOPO-II вперед: 5’-AGGCATCGCATCTTGTTTAG-3 ’и назад: 5’ -CTGTCTCCGGTCTTCCATAA-3 ’; BCL-2 вперед: 5’-GACAACATCGCCCTGTGGAT-3 ’и обратно: 5’-AGGGCCAAACTGAGCAGAGT-3’.Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием TransStart Top Green qPCR SuperMix (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd) с системой LightCycler 480 Real Time PCR System. GAPDH использовался в качестве эндогенного стандарта. Относительную экспрессию генов рассчитывали с помощью метода 2-ΔΔCt [25]. Все эксперименты повторяли трижды.

Иммунофлуоресценция

При культивировании до 90% конфлюэнтности клетки высевали на предметное стекло с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток / мл и инкубировали с TMP (0,2 мМ, 4 мМ) в течение 48 часов.После этого клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) (Hangzhou Sijiqing Company), а затем фиксировали 4% параформальдегидом (Dingguo Biotechnology) в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки пермеабилизировали в 0,1% Triton X-100 / PBS (Sigma-Aldrich) в течение 10 минут и инкубировали с 10% козьей сывороткой в ​​течение 1 часа при 37 ° C. Клетки инкубировали с первичными антителами мышиных моноклональных анти-MRP1 (1: 100), кроличьими моноклональными анти-LRP (1: 100), кроличьими поликлональными анти-GST (1: 250), кроличьими моноклональными анти-BCL-2 (1: 100), кроличьи поликлональные анти-TOPO-II (1: 500) соответственно (Abcam) при 37 ° C в течение 2 часов.После трехкратной промывки PBS клетки окрашивали вторичным антителом, конъюгированным с AlexaFluor 488 (козий антимышиный и козий антикроличий IgG, Abcam, 1: 400) при 37 ° C во влажной кассете в течение 1 часа. Клетки трижды промывали PBS, а затем инкубировали с Hoechst 33342 в концентрации 5 мкг / мл в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем изображения клеток получали с помощью флуоресцентной микроскопии (Nikon 80i, Япония, × 400).

Вестерн-блот

Клетки Pumc-91 / ADM и T24 / DDP обрабатывали TMP (0,4 мМ).После инкубирования в течение 48 часов клетки собирали и трижды промывали PBS в фазе экспоненциального роста. Белковые экстракты готовили с использованием набора для экстракции общего белка (KeyGen, Нанкин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Белок (80 мкг) на образец разделяли в 8–12% SDS-PAGE и затем электропереносили на PVDF-мембрану (Bio-Rad, США) на 1,5 часа. Мембраны блокировали в растворе 5% обезжиренного молока в PBST в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого мембраны инкубировали с первичными антителами мыши или кролика (Abcam, США) против MRP1, LRP, GST, BCL-2 и TOPO-II в разведениях 1: 250, 1: 1000, 1: 250, 1: 100, 1: 500 соответственно и β-актин (ZhongShan Co., Китай) в разведении 1: 500 при 4 ° C в течение ночи. Затем PVDF-мембрану инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими антителами против IgG мыши или антителами против IgG кролика в разведении 1: 1000 в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Полосы обнаруживали с помощью улучшенного хромогенного набора HRP-DAB. Значение интегрированной оптической плотности (IOD) каждой полосы анализировали с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus v 6.0 (MEDIA CYBERNETICS, США). Все эксперименты повторяли трижды.

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью SPSS 17.0 (SPSS lnc., Чикаго, США). T-критерий Стьюдента (двусторонний) и дисперсионный анализ (односторонний ANOVA) были использованы для анализа контрольной группы и групп TMP. Считалось, что значение P менее 0,01 указывает на значительную разницу.

Результаты

Эффект ингибирования роста трех видов лекарственных трав на клетки Pumc-91 / ADM

Rh3, EGCG и TMP могут ингибировать пролиферацию Pumc-91 / ADM в зависимости от дозы, но без зависимости от времени (рис. 2, таблица S1). С увеличением концентрации Rh3, EGCG и TMP рост клеток постепенно замедлялся.После обработки клеток Rh3 (5–100 мкМ), EGCG (10–200 мкМ) и TMP (0–32 мМ) в течение 24 часов, увеличение скорости ингибирования клеток составляло от 2,1% до 58,7%, от 2,2% до 67,7%. , От 2,4% до 56,9%, в течение 48 часов варьировалось от 3,3% до 61,9%, от 4,4% до 69,4%, от 6,4% до 60,9% и за 72 часа варьировалось от 8,5% до 65,2%, от 5,5% до 71,9%, от 6,6% до 62,9% в клетках Pumc-91 / ADM соответственно (рис. 2a, 2b и 2c). Значения 50% ингибирующей концентрации (IC ₅₀ ) через 24, 48 и 72 часа были оценены как 73, 70, 67 мкМ для Rh3 (P> 0.01) (рис. 2d), 167, 160, 152 мкМ для EGCG (P> 0,01) (рис. 2e) и 25,51, 25,08, 24,00 мМ для TMP (P> 0,01) (рис. 2f) соответственно.

Рис. 2. Ингибирующее действие трех видов лекарственных трав на клеточную линию Pumc-91 / ADM.

Кривые выживаемости клеток (a, b, c) и значения IC ₅₀ (d, e, f) Rh3, EGCG и TMP для 24 часов, 48 часов и 72 часов соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.g002

Обратное действие Rh3, EGCG и TMP на клетки рака мочевого пузыря с множественной лекарственной устойчивостью

Мы обнаружили очевидный обратный эффект ТМП среди трех видов лекарственных трав на клетки Pumc-91 / ADM (рис. 3c, таблица S2).Но для Rh3 и EGCG (рис. 3a и 3b) (таблица S2) их не было. Значения IC ₅₀ ADM в комбинации с Rh3, EGCG или TMP для клеток Pumc-91 / ADM показаны в таблице 1. Клетки без лекарственных растений считались контрольной группой. По сравнению с контрольной группой значение ADM IC ₅₀ в экспериментальных группах, получавших ТМП, было заметно снижено. Кратность обращения составляла 1,05 раза (P> 0,01), 2,48 раза (P <0,01) и 4,28 раза (P <0,01) в группах TMP при концентрации 1 мМ, 2 мМ и 4 мМ соответственно.Комбинационный индекс (ДИ) составлял 0,99, 1,28 и 1,49 в группах, получавших ТМП при концентрации 1, 2 и 4 мМ, соответственно (Таблица 1). Между тем, обратный эффект TMP на клетки T24 / DDP также был осуществлен (фиг. 3d) (таблица S3). Кратность обращения составляла 1,05 раза (P> 0,01), 2,03 раза (P <0,01) и 3,25 раза (P <0,01) в группах TMP при концентрации 1 мМ, 2 мМ и 4 мМ, соответственно. Комбинационный индекс (ДИ) составлял 0,98, 1,32 и 1,49 в группах, получавших ТМП при концентрации 1, 2 и 4 мМ, соответственно (таблица 2).Эти результаты продемонстрировали, что TMP оказывает обратное действие на раковые клетки мочевого пузыря с множественной лекарственной устойчивостью в зависимости от дозы.

Рис. 3. Обратное действие трех видов лекарственных трав на клетки рака мочевого пузыря с множественной лекарственной устойчивостью.

Диапазон от 0 до 32 мкг / мл ADM был добавлен в клетки Pumc-91 / ADM с (a) Rh3 (0, 5, 10, 20 мкМ), (b) EGCG (0, 10, 20, 40 мкМ) и (c) ТМП (0, 1, 2, 4 мМ) в течение 48 часов. (d) В клетки T24 / DDP добавляли DDP в диапазоне от 0 до 10 мкг / мл с TMP (0, 1, 2, 4 мМ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.g003

Тем не менее, RF был в 1,13 раза, 1,38 раза, 1,63 раза (P> 0,01) в присутствии Rh3 (5, 10 и 20 мкМ) и в 1,06, 1,22, 1,55 раза (P> 0,01) в присутствии EGCG (10, 20 и 40 мкМ) по отдельности. Комбинационный индекс (ДИ) составлял 1,00, 1,05, 1,04 в группах Rh3 при концентрации 5, 10, 20 мкМ и 0,98, 0,99, 1,00 в группах EGCG при концентрации 10, 20, 40 мкМ соответственно (Таблица 1). .Эти результаты показали, что Rh3 и EGCG не оказывают обратного действия на клетки Pumc-91 / ADM.

Клеточный цикл остановлен в S-фазе после обработки TMP

После инкубации клеток Pumc-91 / ADM и T24 / DDP с TMP в течение 48 часов мы исследовали влияние TMP на распределение клеточного цикла. По сравнению с контрольной группой, обработка TMP (2,4 мМ) в экспериментальных группах приводила к остановке фазы G1 (57,09% и 60,55%, соответственно, против 40,55%) в клетках Pumc-91 / ADM (рис. 4) и ( 40,12% и 46.03% соответственно против 36,27%) в клетках T24 / DDP (рис. 5). Это увеличение популяции клеток G1 сопровождалось уменьшением S-фазы.

Рис. 4. Анализ клеточного цикла клеток Pumc-91 / ADM, обработанных TMP, с использованием проточной цитометрии.

Клетки культивировали с различными концентрациями TMP (a. 0 мМ, b 2 мМ, c 4 мМ) в течение 48 часов. G1, S и G2 указывают фазы клеточного цикла.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.g004

Рис. 5. Анализ клеточного цикла клеток T24 / DDP, обработанных TMP, с использованием проточной цитометрии.

Клетки культивировали с различными концентрациями TMP (a. 0 мМ, b 2 мМ, c 4 мМ) в течение 48 часов. G1, S и G2 указывают фазы клеточного цикла.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.g005

Влияние TMP на уровни мРНК MRP1, LRP, GST, BCL-2 и TOPO-II в клетках рака мочевого пузыря с множественной лекарственной устойчивостью

Чтобы определить, участвует ли экспрессия мРНК MRP1, LRP, GST, BCL-2 и TOPO-II в обратном эффекте TMP на MDR, определяют уровни MRP1, LRP, GST, BCL-2 и TOPO-II в Pumc-91. / Клетки ADM и T24 / DDP, обработанные различными концентрациями TMP, выявляли с помощью qRT-PCR.Обработка TMP вызвала снижение MRP1, GST, BCL-2 (рис. 6a и 6c, таблицы S4 и S5) и повышение TOPO-II (рис. 6b и 6d, таблицы S4 и S5) на уровне мРНК в Pumc-91 / Ячейки ADM и T24 / DDP. Однако не было никакой разницы в белке LRP после обработки клеток TMP. По сравнению с контрольной группой уровни мРНК в группах TMP при концентрациях 2,4 мМ были в 0,29 раза, в 0,06 раза ниже для MRP1 (P <0,01), в 0,39 раза, 0,18 раза для GST (P <0,01), 0,50 раза, 0,20 раза ниже для BCL-2 (P <0.01) и в 0,85 раза, на 0,75 раза ниже для LRP (P> 0,01) в клетках Pumc-91 / ADM (рис. 6а), соответственно. Было заметное снижение, сопровождающееся дозовой зависимостью в группах, получавших ТМП. В клетках T24 / DDP уровни мРНК в группах TMP при концентрациях 2,4 мМ были в 0,14 раза, в 0,01 раза ниже для MRP1 (P <0,01), в 0,13 раза, в 0,10 раза ниже для GST (P < 0,01), 0,01 раза, 0,02 раза ниже для BCL-2 (P <0,01) и 0,83 раза, 0,76 раза ниже для LRP (P> 0,01) (рис. 6c). Однако экспрессия TOPO-II в группах TMP была увеличена.По сравнению с контрольной группой уровни мРНК TOPO-II в группах TMP при концентрациях 2,4 мМ были в 3,4 раза, в 12,5 раза выше в клетках Pumc-91 / ADM и в 2,5 раза, 10,5 раза выше при концентрациях 2,4 мМ в клетках T24 / DDP, соответственно (рис. 6b и 6d).

Рис. 6. Относительная экспрессия уровней мРНК в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP.

Клетки обрабатывали различными концентрациями ТМП (0, 2, 4 мМ) в течение 48 часов. Группа без ТМП считалась контрольной группой.Результаты выражали как отношение гена-мишени к гену домашнего хозяйства (GAPDH). * р <0,01 по сравнению с контрольной группой. а, б. Уровни мРНК MRP1, GST, BCL-2, LRP и TOPO-II в клетках Pumc-91 / ADM. CD. Уровни мРНК MRP1, GST, BCL-2, LRP и TOPO-II в клетках T24 / DDP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.g006

Влияние TMP на уровни белка MRP1, LRP, GST, BCL-2 и TOPO-II в клетках рака мочевого пузыря с множественной лекарственной устойчивостью

Чтобы исследовать, связаны ли уровни мРНК MRP1, LRP, GST, BCL-2 и TOPO-II в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP с экспрессией их белка в клетках, обработанных TMP (2,4 мМ), проведен иммунофлуоресцентный анализ.По сравнению с контрольной группой, экспрессия белков MRP1, GST, BCL-2 была значительно снижена в группах TMP (2,4 мМ) в соответствии с их уровнями мРНК в зависимости от дозы (рис. 7 и 8). Но для TOPO-II было продемонстрировано, что TMP может усиливать его экспрессию (рис. 7 и 8). С увеличением концентрации TMP уровень TOPO-II постепенно увеличивался по сравнению с необработанными клетками. Но для LRP не было разницы между контрольной группой и группами, обработанными TMP (2,4 мМ).Эти результаты показали, что TMP может подавлять экспрессию MRP1, GST, BCL-2 и повышать экспрессию TOPO-II.

Рис. 7. Экспрессия MRP1, LRP, GST, BCL-2 и TOPO-II на уровнях белка, исследованных с помощью иммунофлуоресцентного анализа в клетках Pumc-91 / ADM.

Клетки обрабатывали различными концентрациями ТМП (0, 2, 4 мМ) в течение 48 часов. Группа без ТМП считалась контрольной (увеличение × 400).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0157759.g007

Рис. 8. Экспрессия MRP1, LRP, GST, BCL-2 и TOPO-II на уровнях белка, исследованных с помощью иммунофлуоресцентного анализа в клетках T24 / DDP.

Клетки обрабатывали различными концентрациями ТМП (0, 2, 4 мМ) в течение 48 часов. Группа без ТМП считалась контрольной (увеличение × 400).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.g008

Для количественной оценки уровней этих белков был проведен вестерн-блоттинг MRP1, GST, BCL-2, LRP и TOPO-II (рис. 9, Таблица S6).Экспрессия MRP1, GST, BCL-2 была в 0,28 раза, 0,62 раза и 0,72 раза ниже в группе TMP, чем в контрольной группе в клетках Pumc-91 / ADM (P <0,01), соответственно. В то время как экспрессия MRP1, GST, BCL-2 была в 0,34 раза, 0,56 раза и 0,57 раза ниже в группе TMP, чем в контрольной группе в клетках T24 / DDP (P <0,01). Напротив, экспрессия TOPO-II была в 1,9 раза и 2,75 раза выше в группе TMP по сравнению с контрольной группой в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP соответственно (P <0.01). Принимая во внимание, что не было разницы в экспрессии LRP между группами TMP и контрольной группой в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP.

Рис. 9. Экспрессия MRP1, GST, BCL-2, LRP и TOPO-II на уровнях белка, исследованных с помощью вестерн-блоттинга в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP.

а. электрофореграмма. 1 —— Pumc-91 / ADM TMP0, 2 —— Pumc-91 / ADM TMP4, 3 —— T24 / DDP TMP0, 4 —— T24 / DDP TMP4. до н.э. гистограмма. * р <0,01 по сравнению с контрольной группой.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0157759.g009

Обсуждение

Рак мочевого пузыря — одно из важнейших эпителиальных новообразований во всем мире. Пациенты с раком мочевого пузыря всегда показывают запущенную стадию заболевания при диагностике или рецидив, инвазию и диссеминацию после терапии первой линии, что вызывает плохой прогноз [26]. Адъювантная химиотерапия после операции считается основной стратегией при раке мочевого пузыря. Тем не менее, основной проблемой, ограничивающей успех химиотерапии, является развитие множественной лекарственной устойчивости [27,28].Таким образом, для преодоления лекарственной устойчивости применялась комбинированная терапия, основанная на синергетическом эффекте между лекарственными средствами. Растительные лекарственные средства являются важными агентами с фармацевтическим потенциалом [29]. Современные фармакологические эксперименты подтвердили, что использование лекарственных трав становится все более популярным, особенно у онкологических больных, проявляющих устойчивость к химиотерапии [30]. Этот подход может быть дополнительной или альтернативной терапией химиотерапии. Принимая во внимание узкое терапевтическое окно химиотерапевтических препаратов, синергетический эффект может улучшить терапевтические эффекты и обратить лекарственную устойчивость из-за длительной химиотерапии.

Недавно многие группы сообщили о синергическом противораковом эффекте при комбинированном лечении химиотерапевтическими агентами и естественным соединением на моделях рака in vitro и in vivo [31,32]. Сообщалось, что пероральное введение Rh3 могло ингибировать рост ксенотрансплантатов яичников у голых мышей [33]. При внутривенном введении Rh3 и цисплатина голым мышам с ксенотрансплантатами яичников наблюдался синергетический эффект [34]. Сообщалось также о синергическом эффекте, когда модели мышиных гепатом, сарком и меланомы лечили Rh3 и паклитакселом или митоксантроном [35].EGCG синергетически цитотоксичен для раковых клеток человека, модулируя Р-гликопротеин и рецептор эстрогена [36,37]. Также сообщалось, что EGCG может обратить вспять устойчивость к цисплатину за счет подавления Axl и Tyro3 в клетках рака легких человека [38]. ТМП, как один из основных биологически активных компонентов, очищенных из китайской травы Ligusticum wallichii Franch., Широко используется в лечении сердечно-сосудистых и церебральных заболеваний в Китае [39]. Сообщается, что ТМП действует как противовоспалительное средство на модели астмы у крыс [40].В последнее время многие исследователи сосредоточились на противоопухолевой активности различных раковых клеток. Fu et al. Показали, что ТМП влияет на рост и миграцию клеточной линии глиомы путем ингибирования притока кальция [41]. Аналогичным образом было подтверждено, что ТМП может ингибировать метастазирование меланомы in vivo частично за счет подавления активности фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [42]. Следовательно, ТМП может представлять собой потенциально эффективный вариант лечения опухолей. Один отчет продемонстрировал, что TMP способен обратить вспять MDR клеток BEL-7402 / ADM в ответ на ADM [21].Однако, насколько нам известно, наше исследование впервые позволило обнаружить обратный эффект Rh3, EGCG и TMP в клеточной линии рака мочевого пузыря с множественной лекарственной устойчивостью. В настоящем исследовании EGCG и Rh3 не оказывали синергетического эффекта на рак мочевого пузыря. Но для TMP было продемонстрировано, что TMP способен повышать цитотоксичность противоопухолевых препаратов, обращая вспять MDR клеток Pumc-91 / ADM в ответ на ADM. Обратный эффект TMP был также подтвержден в клетках T24 / DDP. По сравнению с контрольной группой, IC ₅₀ ADM и DDP заметно снижался при увеличении концентрации TMP, что указывает на то, что обратный эффект TMP происходит в зависимости от дозы.Воздействие ТМП на клетки Pumc-91 / ADM и T24 / DDP приводило к остановке клеточного цикла в фазе G1, сопровождаемой уменьшением количества клеток в S-фазе. Важной особенностью раковых клеток является то, что неконтролируемая пролиферация клеток возникает из-за дефектов на протяжении клеточного цикла на G1, G2, S и митотической фазах. Контрольные точки клеточного цикла, включая сеть сигнальных путей протеинкиназ, защищают клетки от повреждений ДНК, вызванных химиотерапевтическими средствами, и предоставляют клеткам необходимое время для восстановления повреждений [43].Следовательно, дефекты контрольных точек клеточного цикла могут вызвать канцерогенез и развитие лекарственной устойчивости. Остановка развития клеточного цикла в фазе G2 обычно давала клеткам возможность защитить свою жизнеспособность после лечения лекарствами [44,45]. В нашем исследовании клеточный цикл, остановленный в фазе G1, подавлял неконтролируемую пролиферацию клеток и избегал восстановления клеток при повреждении лекарством.

Устойчивость к химиотерапевтическим средствам возникает в результате метаболизма нескольких лекарств. Белок множественной лекарственной устойчивости1 (MRP1) как важный белок-переносчик кассеты, связывающей АТФ, влияет на внутриклеточную концентрацию лекарственного средства через изменение притока или оттока лекарственного средства.Сверхэкспрессия MRP1 может снизить внутриклеточную концентрацию и клеточную цитотоксичность противоопухолевых препаратов, таких как адриамицин, винбластин, митоксантрон и этопозид [46–49]. GST обладает ферментативной активностью при детоксикации. Он может снизить концентрацию противоопухолевых препаратов с помощью экспортного насоса GSH-конъюгата [50,51]. Гибель клеток, вызванная апоптозом, является одним из наиболее распространенных механизмов действия противоопухолевых препаратов. BCL-2 считается основным антиапоптотическим белком. В устойчивых к адриамицину H69AR клетках мелкоклеточного рака легких человека, инфицированных BCL-2-интерферирующей РНК, уровень BCL-2 снижался, а также эти клетки были более чувствительны к дауномицину, чем родительские клетки [52].Топоизомераза-II (TOPO-II) является основной мишенью для многих антиканцерогенов. Лекарственная устойчивость к TOPO-II возникает, когда активность и чувствительность целевого фермента TOPO-II снижаются из-за понижающей регуляции или мутации [53]. Белок устойчивости к легким (LRP) с молекулярной массой 99 кДа был идентифицирован как основной белок свода (MVP). Он опосредует резистентность к лекарствам, перекачивая лекарства от внутриклеточных мишеней через экзоцитотические везикулы или молекулы насоса [54]. Таким образом, в этом исследовании мы проанализировали экспрессию этих белков, связанных с лекарственной устойчивостью.Наше исследование продемонстрировало очевидное снижение уровней мРНК и белка MRP1, GST, BCL-2 при обработке TMP в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP. Для TOPO-II обработка TMP привела к увеличению экспрессии TOPO-II в мРНК и уровнях белка. Однако не было различий в экспрессии LRP между контрольной группой и группами, обработанными TMP. Таким образом, эти данные продемонстрировали, что ТМП в сочетании с адриамицином или цисплатином синергетически ингибирует пролиферацию клеток Pumc-91 / ADM и T24 / DDP.TMP может обратить вспять лекарственную устойчивость клеток Pumc-91 / ADM и T24 / DDP.

Кроме того, были четко продемонстрированы экспрессия МЛУ и корреляция с другими рецепторами, такими как стероидные и ксенобиотические рецепторы (SXR), а также их корреляция с клинической эволюцией и поведением. Хорхе Риоха продемонстрировал, что экспрессия SXR имеет значение в качестве предиктора выживаемости независимо от стандартных патологических предикторов для пациентов с инвазивным раком мочевого пузыря [55].

В заключение, мы продемонстрировали, что TMP способен усиливать цитотоксичность антиканцерогена в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP.Тем временем были изучены механизмы этого обратного эффекта. TMP может индуцировать накопление клеток Pumc-91 / ADM и T24 / DDP в фазе G1 клеточного цикла, что сопровождается уменьшением количества клеток в S фазе. Несколько генов и белков, метаболизирующих лекарственные средства, были обнаружены после обработки клеток TMP. По сравнению с контрольной группой, очевидное снижение MRP1, GST, BCL-2 и увеличение TOPO-II было показано в группах, получавших TMP, на уровнях мРНК и белка. Но для LRP не было разницы между контрольной группой и группами TMP.Мы пришли к выводу, что MRP1, GST, BCL-2 и TOPO-II могут быть частично ответственны за обратные эффекты TMP в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP. Эти результаты продемонстрировали, что ТМП может быть потенциальным кандидатом на обратный эффект лекарственной устойчивости при химиотерапии рака мочевого пузыря.

Дополнительная информация

S2 Таблица. Обратные эффекты трех видов лекарственных трав на клетки Pumc-91 / ADM.

Диапазон от 0 до 32 мкг / мл ADM был добавлен в клетки Pumc-91 / ADM с Rh3 (0, 5, 10, 20 мкМ), EGCG (0, 10, 20, 40 мкМ) и TMP (0, 1 , 2, 4 мМ) в течение 48 ч.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.s002

(TIF)

S4 Таблица. Относительная экспрессия MRP1, GST, BCL-2, LRP и TOPO-II на уровнях мРНК в клетках Pumc-91 / ADM.

Клетки обрабатывали различными концентрациями ТМП (0, 2, 4 мМ) в течение 48 часов. Группа без ТМП считалась контрольной группой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.s004

(TIF)

S5 Таблица. Относительная экспрессия MRP1, GST, BCL-2, LRP и TOPO-II на уровнях мРНК в клетках T24 / DDP.

Клетки обрабатывали различными концентрациями ТМП (0, 2, 4 мМ) в течение 48 часов. Группа без ТМП считалась контрольной группой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.s005

(TIF)

S6 Таблица. Экспрессия MRP1, GST, BCL-2, LRP и TOPO-II на уровнях белка, исследованных с помощью вестерн-блоттинга, в клетках Pumc-91 / ADM и T24 / DDP.

Клетки Pumc-91 / ADM и T24 / DDP обрабатывали TMP в концентрации 4 мМ в течение 48 часов.Уровни белков определяли количественно с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus v 6.0. A, ген Taget. Б. β-актин.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0157759.s006

(TIF)

Благодарности

Это исследование финансировалось Пекинским управлением традиционной китайской медицины (2014-ZYJ04) и Пекинской ключевой лабораторией молекулярной молекулярной диагностики мочи (Z151100001615060).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MZ. Проведены эксперименты: SSW TL.Проанализированы данные: SSW TL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SSW TL. Написал статью: SSW MZ.

Список литературы

1. 1.
   Сигел Р.Л., Миллер К.Д., Джемаль А. Статистика рака, 2015. CA Cancer J Clin. 2015; 65: 5–29. pmid: 25559415
2. 2.
   Арантес-Родригес Р., Пинто-Лейте Р., Фидальго-Гонсалвес Л., Палмейра С., Сантос Л., Колако А. и др. Синергетический эффект цисплатина и малата сунитиниба на клеточные линии рака мочевого пузыря человека. Biomed Res Int.2013;.
3. 3.
   Кауфман Д.С., Шипли В.Ю., Фельдман А.С. Рак мочевого пузыря. Ланцет. 2009; 374: 239–249. pmid: 19520422
4. 4.
   Аткинс С.Д., Вжесински Ш. Лучевая терапия плюс химиотерапия при мышечно-инвазивном раке мочевого пузыря. N Engl J Med. 2012; 367: 379–381
5. 5.
   Кришна Р., Майер Л.Д. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) при раке. Механизмы, обращение с использованием модуляторов МДР и роль модуляторов МДР во влиянии на фармакокинетику противоопухолевых препаратов.Eur J Pharm Sci. 2000; 11: 265–283. pmid: 11033070
6. 6.
   Сюй Н, Шэнь Ц., Ло И, Ся Л, Сюэ Ф, Ся Цюй и др. Активная регуляция mir-130a увеличивает лекарственную устойчивость за счет регулирования передачи сигналов runx3 и wnt в обработанных цисплатином hcc клетках. Biochem Biophys Res Commun. 2012; 425: 468–472. pmid: 22846564
7. 7.
   Хун Л., Пяо И, Хан И, Ван Дж, Чжан Х, Ду И и др. Цинковая лента, содержащая домен 1 (znrd1), опосредует множественную лекарственную устойчивость лейкозных клеток посредством регуляции p-гликопротеина и bcl-2.Mol Cancer Ther. 2005; 4: 1936–1942. pmid: 16373708
8. 8.
   Готтесман М.М. Механизмы лекарственной устойчивости рака. Annu Rev Med. 2002; 53: 615–627. pmid: 11818492
9. 9.
   Лонгли Д. Б., Джонстон П. Г.. Молекулярные механизмы лекарственной устойчивости. J Pathol. 2005; 205: 275–292. pmid: 15641020
10. 10.
    Hasegawa S, Abe T., Naito S, Kotoh S, Kumazawa J, Hipfner DR, et al. Экспрессия белка, ассоциированного с множественной лекарственной устойчивостью (mrp), mdr1 и ДНК-топоизомеразы II в клеточных линиях рака мочевого пузыря с множественной лекарственной устойчивостью человека.Br J Рак. 1995; 71: 907–913. pmid: 7734314
11. 11.
    Hoffmann AC, Wild P, Leicht C, Bertz S, Danenberg KD, Danenberg PV и др. Экспрессия Mdr1 и ercc1 предсказывает исход пациентов с местнораспространенным раком мочевого пузыря, получающих адъювантную химиотерапию. Неоплазия. 2010; 12: 628–636. pmid: 20689757
12. 12.
    Серретта В., Павоне С., Аллегро Р., Велла М., Сангедолче Р., Поркаси Р. и др. Корреляция между экспрессией gp-170, прогнозом и химиорезистентностью поверхностной карциномы мочевого пузыря.J Cancer Res Clin Oncol. 2003; 129: 472–476. pmid: 12884023
13. 13.
    Тада Ю., Вада М., Мигита Т., Нагаяма Дж., Хиносита Е., Мочида Ю. и др. Повышенная экспрессия белков, связанных с множественной лекарственной устойчивостью, при раке мочевого пузыря во время клинического течения и лекарственной устойчивости к доксорубицину. Int J Cancer. 2002; 98: 630–635. pmid: 11920626
14. 14.
    Diestra JE, Condom E, Del Muro XG, Scheffer GL, Perez J, Zurita AJ и др. Экспрессия белков множественной лекарственной устойчивости p-гликопротеина, белка множественной лекарственной устойчивости 1, белка устойчивости к раку груди и белка, связанного с резистентностью легких, при местнораспространенном раке мочевого пузыря, леченном неоадъювантной химиотерапией: биологические и клинические последствия.J Urol. 2003; 170: 1383–1387. pmid: 14501774
15. 15.
    Патель Дж., Митра АК. Стратегии преодоления одновременного опосредованного p-гликопротеином оттока и метаболизма лекарств, опосредованного cyp3a4. Фармакогеномика. 2001; 2: 401–415. pmid: 11722289
16. 16.
    Ким Х.С., Ли Э. Х., Ко СР, Чой КДЖ, Пак Дж. Х., Им DS. Влияние гинсенозидов rg3 и rh3 на пролиферацию клеток рака простаты. Arch Pharm Res. 2004; 27: 429–435. pmid: 15180309
17. 17.
    Fei XF, Wang BX, Tashiro S, Li TJ, Ma JS, Ikejima T.Апоптотические эффекты гинсенозида rh3 на клетки злокачественной меланомы человека a375-s2. Acta Pharmacol Sin. 2002; 23: 315–322. pmid: 11931705
18. 18.
    Ли К.Ю., Пак Дж.А., Чанг Э, Ли Ю.Х., Ким СИ, Ли С.К. Гинзенозид-rh3 блокирует клеточный цикл клеток sk-hep-1 на границе g1 / s, избирательно индуцируя экспрессию белка p27kip1. Cancer Lett. 1996; 110: 193–200. pmid: 01
19. 19.
    Боде AM, Донг З. Нацеливание на пути передачи сигнала химиопрофилактическими агентами.Mutat Res. 2004; 555: 33–51. pmid: 15476850
20. 20.
    Park OJ, Surh YJ. Химиопрофилактический потенциал эпигаллокатехин галлата и генистеина: данные эпидемиологических и лабораторных исследований. Toxicol Lett. 2004; 150: 43–56. pmid: 15068824
21. 21.
    Ван XB, Wang SS, Zhang QF, Liu M, Li HL, Liu Y и др. Ингибирование тетраметилпиразина на p-gp, mrp2, mrp3 и mrp5 в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека с множественной лекарственной устойчивостью. Oncol Rep. 2009; 23: 211–215.
22. 22.Чжан Минь, Цзинь Шэн, Чжан Ман. Установление и оценка биологических характеристик линии клеток Pumc-91 / ADM рака мочевого пузыря человека с множественной лекарственной устойчивостью. Журнал медицинских исследований. 2009; 38 (1): 70–72.
23. 23.
    Чжао Ман, Чжан Ман, Ма Пин. Создание линии клеток рака мочевого пузыря Т24 человека с множественной лекарственной устойчивостью к цисплатину и ее биологические характеристики. Иммуноанализ и клиническая медицина. 2015; 22 (4): 338–341.
24. 24.
    Хуан Ф, Ву XN, Чен Дж, Ван У., Лю Ц. Ф.Ресвератрол отменяет множественную лекарственную устойчивость в доксорубицин-резистентных клетках рака молочной железы человека. Exp Ther Med. 2014; 7: 1611–1616. pmid: 24926353
25. 25.
    Ливак К.Дж., Шмитген Т.Д. Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной pcr в реальном времени и метода 2 (-delta delta c (t)). Методы. 2001; 25: 402–408. pmid: 11846609
26. 26.
    Джейкобс Б.Л., Ли СТ, Монти Дж. Рак мочевого пузыря в 2010 году: как далеко мы зашли? CA Cancer J Clin. 2010; 60: 244–272. pmid: 20566675
27. 27.Сиддик Ж. Цисплатин: механизм цитотоксического действия и молекулярная основа устойчивости. Онкоген. 2003; 22: 7265–7279. pmid: 14576837
28. 28.
    Коберле Б., Томичич М.Т., Усанова С., Кайна Б. Устойчивость к цисплатину: доклинические данные и клинические последствия. Biochim Biophys Acta. 2010; 1806: 172–182. pmid: 20647037
29. 29.
    Xu HW, Xu L, Hao JH, Qin CY, Liu H: Экспрессия p-гликопротеина и белка, связанного с множественной лекарственной устойчивостью, связана с множественной лекарственной устойчивостью при раке желудка.J Int Med Res. 2010; 38: 34–42. pmid: 20233511
30. 30.
    Сервелло М., Монтальто Г. Циклооксигеназы при гепатоцеллюлярной карциноме. Мир Дж. Гастроэнтерол. 2006; 12: 5113–5121. pmid: 16937518
31. 31.
    Хошёмн С, Манске ГК, Лью С.М., Вальд С.Л., Пенар ПЛ. Синергетическое действие генистеина и цисплатина на ингибирование роста и цитотоксичность клеток медуллобластомы человека. Педиатр Нейрохирург. 2000; 33: 123–131. pmid: 11096359
32. 32.
    Чжао Х., Чжу В., Се П, Ли Х, Чжан Х, Сунь Х и др.Исследование фазы i одновременной химиотерапии и лучевой терапии грудной клетки с пероральной защитой эпигаллокатехин-3-галлатом у пациентов с местнораспространенным немелкоклеточным раком легкого iii стадии. Радиотренажер Oncol. 2014; 110: 132–136. pmid: 24444526
33. 33.
    Наката Х., Кикучи Й., Тоде Т., Хирата Дж., Кита Т., Исии К. и др. Подавляющее действие гинсенозида rh3 на рост опухоли у мышей nude, несущих человеческие раковые клетки яичников. Jpn J Cancer Res. 1998; 89: 733–740. pmid: 9738980
34. 34.Кикучи Й., Саса Х., Кита Т., Хирата Дж., Тоде Т., Нагата И. Ингибирование пролиферации клеток рака яичников человека in vitro гинсенозидом rh3 и адъювантными эффектами цисплатина in vivo. Противораковые препараты. 1991; 2: 63–67. pmid: 1958854
35. 35.
    Jia WW, Bu X, Philips D, Yan H, Liu G, Chen X и др. Rh3, соединение, экстрагированное из женьшеня, повышает чувствительность опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью к химиотерапии. Может J Physiol Pharmacol. 2004; 82: 431–437. pmid: 15389289
36. 36.Чисхолм К., Брей Б.Дж., Розенгрен Р.Дж. Тамоксифен и галлат эпигаллокатехина синергетически цитотоксичны по отношению к клеткам рака молочной железы человека mda-mb-231. Противораковые препараты. 2004; 15: 889–897. pmid: 15457130
37. 37.
    Цянь Ф., Вэй Д., Чжан К., Ян С. Модуляция функции р-гликопротеина и изменение множественной лекарственной устойчивости с помощью (-) — галлата эпигаллокатехина в раковых клетках человека. Biomed Pharmacother. 2005; 59: 64–69. pmid: 15795098
38. 38.
    Kim KC, Lee C. Обращение устойчивости к цисплатину с помощью галлата эпигаллокатехина опосредуется подавлением экспрессии axl и tyro 3 в клетках рака легких человека.Корейский J Physiol Pharmacol. 2014; 18: 61–66. pmid: 24634598
39. 39.
    Ли В.М., Лю Х.Т., Ли XY, Ву Джи, Сюй Дж., Тэн Ю.З. и др. Влияние тетраметилпиразина на вызванное перекисью водорода окислительное повреждение эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2009; 106: 45–52. pmid: 19821832
40. 40.
    Xiong L, Fang ZY, Tao XN, Bai M, Feng G. Эффект и механизм лигустразина на цитокины th2 / th3 в модели астмы у крыс. Am J Chin Med. 2007; 35: 1011–1020.pmid: 18186587
41. 41.
    Fu YS, Lin YY, Chou SC, Tsai TH, Kao LS, Hsu SY и др. Тетраметилпиразин подавляет активность клеток глиомы и нейроэксайтотоксичность глутамата: потенциальное терапевтическое применение для лечения глиом. Neuro Oncol. 2008; 10: 139–152. pmid: 18314418
42. 42.
    Chen L, Lu Y, Wu JM, Xu B, Zhang LJ, Gao M и др. Лигустразин подавляет метастазирование меланомы b16f10 и подавляет ангиогенез, вызванный фактором роста эндотелия сосудов.Biochem Biophys Res Commun. 2009; 386: 374–379. pmid: 19523924
43. 43.
    Санкар А., Линдси-Больц Л.А., Унсал-Качмаз К., Линн С.: Молекулярные механизмы репарации ДНК млекопитающих и контрольные точки повреждения ДНК. Анну Рев Биохим. 2004; 73: 39–85. pmid: 15189136
44. 44.
    Хапке Г., Инь М.Б., Растум Ю.М. Нацеливание на молекулярные сигналы в путях chk1 как новый подход к преодолению лекарственной устойчивости. Раковые метастазы Rev. 2001; 20: 109–115. pmid: 11831638
45. 45.
    Xiao Z, Chen Z, Gunasekera AH, Sowin TJ, Rosenberg SH, Fesik S, et al.Chk1 опосредует s- и g2-арест через деградацию cdc25a в ответ на повреждающие ДНК агенты. J Biol Chem. 2003; 278: 21767–21773. pmid: 12676925
46. 46.
    Исикава Ю., Нагаи Дж., Окада Ю., Сато К., Юмото Р., Такано М. Функция и экспрессия переносчиков кассет, связывающих атр, в культивируемых клетках ретинобластомы человека y79. Биол Фарм Булл. 2010; 33: 504–511. pmid: 201

47. 47.
    Чен З.С., Фурукава Т., Сумизава Т., Оно К., Уэда К., Сето К. и др. Atp-зависимый отток cpt-11 и sn-38 белком множественной лекарственной устойчивости (mrp) и его ингибирование pak-104p.Mol Pharmacol. 1999; 55: 921–928. pmid: 10220571
48. 48.
    Ходададиан М., Леру М.Э., Озенн Э., Гош С.К., Фаркуар Д., Эванс Р. и др. Mrp- и bcl-2-опосредованная лекарственная устойчивость в sclc человека: эффекты апоптотических сфинголипидов in vitro. Рак легких. 2009; 66: 48–57. pmid: 19195736
49. 49.
    Грубер Б.М., Бубко И., Кшиштон-Русян Дж., Анушевская Э.Л. Синергетическое действие доксорубицина и сулиндака на клетки карциномы шейки матки человека — исследования возможных механизмов. Med Sci Monit.2009; 16: BR45–51.
50. 50.
    Каллен К.Дж., Ньюкирк К.А., Шумакер Л.М., Альдосари Н., Роне Д.Д., Хаддад Б.Р. Амплификация глутатион-s-трансферазы pi связана с устойчивостью к цисплатину в клеточных линиях плоскоклеточного рака головы и шеи и в первичных опухолях. Cancer Res. 2003; 63: 8097–8102. pmid: 14678959
51. 51.
    Сакамото М., Кондо А., Кавасаки К., Гото Т., Сакамото Х., Мияке К. и др. Анализ профилей экспрессии генов, связанных с устойчивостью к цисплатину в клеточных линиях и тканях рака яичников человека, с использованием микроматрицы cdna.Hum Cell. 2001; 14: 305–315. pmid: 11925933
52. 52.
    Паланиянди К., Чжао К., Чанг ХБ. Инфекция клеток h69ar ретровирусными частицами, несущими интерферирующую РНКи, значительно снижает множественную лекарственную устойчивость этих клеток мелкоклеточного рака легкого. Int J Biochem Mol Biol. 2011; 2: 155–167. pmid: 21968975
53. 53.
    Келлнер У., Сехестед М., Дженсен П.Б., Гизелер Ф., Рудольф П. Виновник и жертва — ДНК-топоизомераза II. Ланцет Онкол. 2002; 3: 235–243. pmid: 12067686
54. 54.Scheffer GL, Schroeijers AB, Izquierdo MA, Wiemer EA, Scheper RJ. Белок, связанный с устойчивостью легких / белок главного свода и своды при мультирезистентном раке. Curr Opin Oncol. 2000; 12: 550–556. pmid: 11085454
55. 55.
    Rioja J, Bandres E, Rosell Costa D, Rincon A, Lopez I, Zudaire Bergera JJ и др. Связь экспрессии стероидного и ксенобиотического рецептора (sxr) и гена множественной лекарственной устойчивости 1 (mdr1) с выживаемостью среди пациентов с инвазивной карциномой мочевого пузыря. BJU Int.2010; 107: 1833–1838. pmid: 20840328

Определение обратного разделения запаса

Что такое обратное деление запаса?

Обратное дробление акций — это тип корпоративных действий, которые объединяют количество существующих акций в меньшее количество акций, которые пропорционально более ценные. Уменьшение общего количества акций в обращении на открытом рынке может преследоваться по ряду причин и часто сигнализирует компании о бедствии.

Обратное дробление акций делит существующее общее количество акций на такое число, как пять или десять, что в таком случае будет называться обратным дроблением 1 к 5 или 1 к 10 соответственно.Обратное дробление акций также известно как консолидация акций, слияние акций или откат акций и является противоположностью дробления акций, когда акция делится (разбивается) на несколько частей.

Ключевые выводы

• Обратное дробление акций консолидирует количество существующих акций, принадлежащих акционерам, в меньшее количество акций, пропорционально более ценное.
• Обратное дробление акций напрямую не влияет на стоимость компании.
• Тем не менее, это часто является сигналом компании, терпящей бедствие, поскольку повышает стоимость акций, которые в остальном недооценены.
• Сохранение актуальности и недопущение исключения из списка — наиболее частые причины, по которым корпорации следует этой стратегии.

Смотрите сейчас: как работает обратное деление акций?

Общие сведения о обратном разделении запаса

В зависимости от развития рынка и ситуации компании могут предпринять несколько действий на корпоративном уровне, которые могут повлиять на структуру их капитала. Одним из них является обратное дробление акций, при котором существующие корпоративные акции эффективно объединяются для создания меньшего количества пропорционально более ценных акций.Поскольку компании не создают никакой ценности за счет уменьшения количества акций, цена за акцию увеличивается пропорционально.

Повышение цены на акцию является основной причиной, по которой компании выбирают обратное дробление акций, и соответствующие коэффициенты могут варьироваться от 1 к 2 до 1 к 100. Обратное дробление акций не влияет на стоимость корпорации, хотя обычно оно является результатом значительного снижения стоимости ее акций. Негативный подтекст, связанный с таким действием, часто приводит к поражению, поскольку акции снова подвергаются давлению со стороны продавцов.

Обратное дробление акций предлагается руководством компании и требует согласия акционеров посредством их права голоса.

Важно

Биржа может временно добавить суффикс (D) к тикеру компании, чтобы указать, что компания проходит процедуру обратного дробления акций.

Пример обратного разделения запаса

Допустим, у фармацевтической компании есть десять миллионов акций в обращении, которые продаются по цене 5 долларов за акцию.Поскольку цена акций ниже, руководство компании может пожелать искусственно завышать цену за акцию.

Они решают пойти на обратное дробление акций 1 к 5, что по сути означает слияние пяти существующих акций в одну новую. После завершения корпоративных действий у компании будет (10 миллионов / 5) 2 миллиона новых акций, каждая из которых теперь стоит (5 долларов * 5) 25 долларов за штуку.

Пропорциональное изменение цены акций также подтверждает тот факт, что компания не создала никакой реальной стоимости, просто выполнив обратное дробление акций.Его общая стоимость, представленная рыночной капитализацией, до и после корпоративного действия должна оставаться неизменной.

• Раньше рыночная капитализация = Раньше нет. от общего числа акций * предыдущая цена за акцию = 10 миллионов * 5 долларов = 50 миллионов долларов
• Новая рыночная капитализация = Новый № от общего числа акций * новая цена за акцию = 2 миллиона * 25 долларов = 50 миллионов долларов

Фактором, по которому руководство компании решает пойти на обратное дробление акций, становится коэффициент, на который рынок автоматически корректирует цену акций.

Преимущества обратного деления запаса

Существует ряд причин, по которым компания может принять решение сократить количество своих акций, находящихся в обращении на рынке.

Предотвратить удаление из основной биржи

Цена акции могла упасть до рекордно низкого уровня, что может сделать ее уязвимой для дальнейшего давления рынка и других неблагоприятных событий, таких как невыполнение требований листинга на бирже. Биржа обычно устанавливает минимальную цену предложения для котируемой акции.Если акция упадет ниже этой цены предложения и останется ниже этого порогового уровня в течение определенного периода, она рискует быть исключенной из биржи.

Например, NASDAQ может исключить из списка акции, которые постоянно торгуются ниже 1 доллара за акцию. Исключение из биржи на национальном уровне переводит акции компании в состояние «копейки», вынуждая их размещаться на доске объявлений для внебиржевой торговли (OTCBB) или на розовых листах. После размещения на этих альтернативных рынках акций с низкой стоимостью их становится сложнее покупать и продавать.

Привлечь крупных инвесторов

Компании также поддерживают более высокие цены на акции за счет обратного дробления акций, поскольку многие институциональные инвесторы и паевые инвестиционные фонды придерживаются политики против открытия позиций по акциям, цена которых ниже минимального значения. Даже если компания остается свободной от риска исключения из списка биржей, ее неспособность претендовать на покупку такими крупными инвесторами подрывает ее торговую ликвидность и репутацию.

Регуляторы Satisfy

В разных юрисдикциях по всему миру регулирование компании зависит, помимо других факторов, от количества акционеров.Уменьшая количество акций, компании иногда стремятся уменьшить количество акционеров, чтобы подпадать под действие их привилегированного регулирующего органа или привилегированного свода законов. Компании, которые хотят стать частными, могут также попытаться сократить количество акционеров с помощью таких мер.

Повышение дополнительных цен

Компании, планирующие создать и разместить дочернюю компанию, независимую компанию, созданную путем продажи или распределения новых акций существующего бизнеса или подразделения материнской компании, также могут использовать обратное дробление для получения привлекательных цен.Например, если акции компании, планирующей выделение, торгуются на более низких уровнях, ей может быть сложно установить более высокую цену на акции дочерней компании. Эта проблема потенциально может быть решена путем обратного разделения акций и увеличения стоимости каждой из них.

Критика обратного дробления запасов

Как правило, участники рынка не воспринимают обратное дробление акций положительно. Это указывает на то, что цена акций упала, и что руководство компании пытается искусственно завышать цены без каких-либо реальных деловых предложений.

Кроме того, ликвидность также может сказаться на снижении количества акций на открытом рынке.

Реальные примеры обратного деления запаса

Обратное дробление акций было популярно в эпоху после пузыря доткомов, когда стоимость акций многих компаний упала до рекордно низких уровней. Только в 2001 году более 700 компаний пошли на обратное дробление акций.

В апреле 2002 года крупнейшая коммуникационная компания США.S., AT&T Inc. (T), объявила, что планирует обратное разделение акций 1 к 5 в дополнение к планам выделения своего подразделения кабельного телевидения и слияния его с Comcast Corp. (CMCSA). Корпоративное мероприятие было запланировано, поскольку AT&T опасалась, что выделение может привести к значительному снижению цены ее акций и повлиять на ликвидность, бизнес и ее способность привлекать капитал.

Другие регулярные примеры обратного дробления акций включают множество небольших, часто неприбыльных компаний, занимающихся исследованиями и разработками (НИОКР), у которых нет никаких прибыльных или востребованных на рынке продуктов или услуг.В таких случаях компании подвергаются этому корпоративному действию просто для того, чтобы сохранить свой листинг на ведущей фондовой бирже.

Часто задаваемые вопросы

Зачем компании проводить обратное дробление акций?

Обратное дробление обычно производится, когда цена акции падает слишком низко, что ставит ее под угрозу исключения из листинга биржи за несоблюдение определенных требований к минимальной цене. Более высокая цена акций также может привлечь определенных инвесторов, которые не рассматривали бы копеечные акции для своих портфелей.

Что произойдет, если я владею акциями, которые подвергаются обратному дроблению?

При обратном дроблении зарегистрированные акционеры увидят уменьшение количества принадлежащих им акций, но также увидят, что цена каждой акции увеличится сопоставимым образом. Например, при обратном дроблении акций 1:10, если вы владели 1000 акций, которые торговались по 5 долларов непосредственно перед разделением, вы бы тогда владели 100 акциями по 50 долларов каждая. Ваш брокер обработает это автоматически, поэтому вам ничего не нужно делать.Обратное разделение не повлияет на ваши налоги.

Обратное разделение — это хорошо или плохо?

Часто обратное дробление рассматривается негативно, поскольку оно сигнализирует о том, что цена акций компании значительно снизилась, что может поставить ее под угрозу исключения из листинга. Акции с более высокой ценой после дробления также могут быть менее привлекательными для определенных розничных инвесторов, которые предпочитают акции с более низкими ценами.

Почему у меня в ETN так много обратных разделений?

Некоторые биржевые продукты, такие как ETN (торгуемые на бирже векселя), естественно, со временем обесцениваются и должны регулярно подвергаться обратному дроблению, но эти продукты не предназначены для хранения дольше нескольких часов или дней.Это связано с тем, что ETN технически являются долговыми инструментами, которые содержат производные инструменты на такие продукты, как товары или инструменты, связанные с волатильностью, а не фактические базовые активы.

История разделительной линии

Линдли С. Батлер, 2006

История разделительной линии относится к живому отчету, написанному комиссаром Вирджинии Уильямом Бердом II, о пограничной линии Северная Каролина-Вирджиния, которая была обследована совместной комиссией в 1728 году, поскольку Каролины должны были быть проданы короне их лорды-владельцы.Работа, полное название которой — История разделительной линии между Вирджинией и Северной Каролиной. Пробежка в год от Рождества Христова 1728–, стала классикой южной колониальной литературы.

Пограничная экспедиция была первым исследованием большей части приграничной области, и городской Берд живо описал чудеса природы, флору, фауну и индейцев этой области. Его юмористические зарисовки ленивых приграничных жителей Каролины, населяющих «Любберленд», развлекали читателей с момента публикации повествования в 1841 году.Берд был так восхищен красотой и кажущимся плодородием долины реки Дэн, что приобрел 20 000 акров этого региона у уполномоченных Северной Каролины и назвал свой урочище «Землей Эдема».

Артикул:

Луи Б. Райт, Прозаические произведения Уильяма Берда из Вестовера (1966).

Дополнительные ресурсы:

Берд, Уильям. Рукописи Вестовера: содержат историю раздела между Вирджинией и Северной Каролиной; Путешествие в райскую землю, А.Д. 1733; и Прогресс к шахтам . Петербург: Эдмунд и Джулиан К. Раффин. 1841. https://archive.org/stream/westovermani00byrd#page/n3/mode/2up (по состоянию на 21 августа 2012 г.).

Кэупер, Джеффри. «Новое господство в Старом Доминионе: Укрепление Уильяма Берда в Тайной Истории Линии». Южный литературный журнал 36. Номер 1. Осень 2003 г., стр. 121–139. http://www.jstor.org/stable/20078386 (по состоянию на 21 августа 2012 г.).

Мастерсон, Джеймс Р. «Уильям Берд в Любберленде.» American Literature 9. No. 2. May 1937. p. 153-170. Http://www.jstor.org/stable/2920039 (по состоянию на 21 августа 2012 г.).

Вудфин, Мод Х. «Рукописные истории разделительной линии Томаса Джефферсона и Уильяма Берда». Ежеквартальный вестник Уильяма и Мэри . Третья серия. Vol. 1, № 4. Октябрь 1944 г. с. 363-373. http://www.jstor.org/stable/1922766 (по состоянию на 21 августа 2012 г.).

Вудфин, Мод Х. «Недостающие страницы» Тайной истории линии «Уильяма Берда.» The William and Mary Quarterly . Third Series, Vol. 2, No. 1, January 1945. http://www.jstor.org/stable/1920688 (по состоянию на 21 августа 2012 г.).

Исследователи NIDCD изучают влияние протеина на развитие внутреннего уха

На животных моделях ученые продемонстрировали, что белок под названием Emx2 имеет решающее значение для того, как специализированные клетки, важные для поддержания слуха и равновесия, располагаются во внутреннем ухе, согласно сообщению в блоге Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств. (NIDCD) веб-сайт, на котором резюмируется исследование.Emx2 — это фактор транскрипции, тип белка, который играет роль в регуляции генов. Исследование, проведенное учеными из NIDCD, входящего в состав Национального института здоровья (NIH), предлагает новое понимание того, как развиваются и функционируют специализированные сенсорные волосковые клетки, предоставляя ученым возможность изучить новые способы лечения потери слуха, нарушений равновесия и глухоты. . Результаты были опубликованы 7 марта 2017 года в eLife .
исследователи NIDCD Дорис Ву, доктор философии, руководитель отдела регенерации и развития сенсорных клеток; Кэти Киндт, доктор философии, и.о. начальника отдела развития и функций сенсорных клеток; и Тао Цзян, докторант Университета Мэриленд в Колледж-Парке, стремился описать, как формируются волосковые клетки и пучки волос во внутреннем ухе, исследуя роль Emx2, белка, который, как известно, необходим для развития внутреннего уха. конструкции.Сначала они обратились к мышам, которые сыграли решающую роль в том, чтобы помочь ученым понять, как функционируют сложные части внутреннего уха у людей.

Линия смены полярности (LPR) и расположение Emx2 внутри двух структур внутреннего уха. Стрелки указывают ориентацию пучка волос.
Источник: eLife

По словам исследователей, каждый пучок волос во внутреннем ухе изгибается только в одном направлении, чтобы включить волосковую клетку; когда жгут изгибается в противоположном направлении, он деактивируется или выключается, и каналы, воспринимающие вибрации, закрываются.Пучки волос в различных органах чувств внутреннего уха ориентированы по точному рисунку. Ученые только начинают понимать, как волосковые клетки определяют, в каком направлении направлять пучки волос, чтобы они могли выполнять свою работу.
В тех частях внутреннего уха, где волосковые клетки и их пучки волос преобразуют звуковые колебания в сигналы для мозга, пучки волос ориентированы в одном направлении. То же самое верно и для пучков волос, участвующих в некоторых аспектах баланса, известных как угловое ускорение.Но для волосковых клеток, участвующих в линейном ускорении — или о том, как голова определяет направление движения вперед и назад — пучки волос делятся на две области, ориентированные в противоположных направлениях, что ученые называют «обратной полярностью». Пучки волос обращены друг к другу или друг от друга, в зависимости от того, находятся ли они в сумочке или в мешочке, двух структурах внутреннего уха, участвующих в балансе. У млекопитающих разделительная линия, по которой пучки волос ориентированы в противоположных направлениях, называется линией смены полярности (LPR).
Используя анализ экспрессии генов и анализ потери и увеличения функции у мышей, у которых либо отсутствовал Emx2, либо имелось дополнительное количество белка, ученые обнаружили, что Emx2 экспрессируется только на одной стороне LPR. Вдобавок они обнаружили, что Emx2 меняет полярность пучка волос на 180 градусов, тем самым ориентируя пучки волос в области Emx2 в противоположных направлениях от пучков волос на другой стороне LPR. Когда Emx2 отсутствовал, пучки волос в одном месте располагались так, чтобы смотреть в одном направлении.
Посмотрев на других животных, чтобы увидеть, играет ли Emx2 ту же роль, они обнаружили, что Emx2 меняет ориентацию пучков волос в невромасте рыбок данио, органе, где находятся волосковые клетки с обратной полярностью, чувствительные к движению воды.
Эти результаты подтверждают, что Emx2 играет ключевую роль в установлении структурной основы полярности пучков волос и установлении LPR, согласно NIDCD. Если будет обнаружено, что Emx2 действует аналогичным образом у людей, как и ожидалось, результаты могут помочь в усовершенствовании методов лечения потери слуха и нарушений равновесия.Они также могут продвинуть исследования в понимании механизмов, лежащих в основе развития сенсорных волосковых клеток в органах, отличных от внутреннего уха.
Эта работа была поддержана в очных лабораториях NIDCD (ZIA DC000021 и ZIA DC000085).
Оригинальная бумага: Jiang T, Kindt K, Wu DK. Фактор транскрипции Emx2 контролирует ориентацию стереоцилиарного пучка сенсорных волосковых клеток. eLife. 7 марта 2017 г .; 6. doi: 10.7554 / eLife.23661
Источник: NIDCD, eLife
Изображение: NIDCD, eLife

Обращение зеркала

и визуальное вращение изучаются и консолидируются с помощью отдельных механизмов: перекалибровка или обучение De Novo?

Введение

Люди хорошо умеют приспосабливать свои движения к меняющимся требованиям задачи (Helmholtz, 1866; McLaughlin, 1967; Gentilucci et al., 1995). Изучение новой задачи требует изменения функций, которые переводят цели (и состояния) в моторные команды. Эти функции синонимично называются зрительно-моторными отображениями, политиками управления или обратными моделями (Sutton and Barto, 1998; Todorov and Jordan, 2002).

Но все ли новые задачи изучаются одинаково? Здесь мы сравниваем процессы обучения для двух различных зрительно-моторных преобразований: визуального вращения (VR) и зеркального обращения (MR). Было высказано предположение, что MR и VR изучаются с использованием отдельных механизмов обучения (Werner and Bock, 2010).Здесь мы предполагаем, что виртуальная реальность может быть изучена путем постепенной перекалибровки существующей политики управления, тогда как MR требует создания нового сопоставления. Эта идея мотивирована тем, как двигательная система использует ошибку для обновления будущих движений (рис. 1). При столкновении с VR поправка, рассчитанная согласно старой политике, будет направлена ​​приблизительно (для поворотов <90 °) в соответствующем направлении. Таким образом, новая политика может быть изучена путем обновления следующей моторной команды с поправкой, рассчитанной после устаревшего сопоставления (Kawato and Gomi, 1992).Повторное применение этого правила обучения приводит к правильной политике. Однако во время MR обновление было выведено из старых точек сопоставления в неправильном направлении, и вместо этого пришлось бы получить новую политику.

Рисунок 1.

Схематический чертеж повторной калибровки во время MR и VR. Вертикальная линия через дефис указывает ось поворота зеркала. В испытании n движение руки (красная) к цели -20 ° (рис. 2 для системы координат) приводит к тому, что курсор (синий) перемещается на 20 °, что приводит к ошибке (черная стрелка с дефисом) в 40 °.Часть этого вектора ошибки используется для обновления следующей команды двигателя. Таким образом, при испытании n + 1 направление движения руки (сплошная красная стрелка) смещено по сравнению с предыдущим направлением движения (красная стрелка с дефисом). Во время VR (вверху) это приводит к уменьшению ошибок между курсором (сплошная синяя стрелка) и целью по сравнению с предыдущим перемещением. Во время MR (внизу) одно и то же обновление приводит к увеличению количества ошибок.

Кракауэр и его коллеги предположили, что разница между повторной калибровкой и сбором данных видна в компромиссе между скоростью и точностью (Reis et al., 2009; Шмуэлоф и др., 2012). Поскольку для быстрых последовательных перемещений требуется быстрое генерирование команд прямой связи и обратной связи, это, вероятно, связано со скоростью основных вычислительных процессов: когда система повторно калибрует хорошо изученную политику управления, она должна иметь возможность использовать существующие быстрые автоматические процессы и генерировать точные ответы даже в сжатые сроки. Однако создание новой политики контроля должно включать сначала более медленные и, возможно, более явные компоненты (Hikosaka et al., 2002), что требует дополнительного времени обработки. Только с длительной практикой он должен стать автоматизированным и достичь эквивалентной производительности за более короткие промежутки времени. Таким образом, мы ожидали, что приобретение политики контроля будет сопровождаться сдвигом в компромиссах с точностью до времени. Мы проверили эту идею, изучив быстрые команды прямой связи и обратной связи.

Наконец, мы также проверили, отличаются ли VR- и MR-обучение по способу консолидации памяти между сессиями. Задачи на адаптацию обычно показывают забывание между сессиями (Тонг и др., 2002; Классен и др., 2005; Кракауэр и др., 2005; Trempe and Proteau, 2010), в то время как задачи по обучению навыкам, такие как изучение новых последовательностей движений пальцев, демонстрируют небольшое забвение (Reis et al., 2009), а иногда даже успехи в автономном режиме (Stickgold, 2005; Doyon et al., 2009). ; Brawn et al., 2010; Wright et al., 2010; Abe et al., 2011). Учитывая, что задачи по обучению навыкам также характеризуются сдвигами в соотношении скорости и точности (Reis et al., 2009; Shmuelof et al., 2012), мы предположили, что MR-обучение также может показывать улучшение автономности между сессиями.

Результаты

Компромисс точности времени в командах с прямой связью

Мы предположили, что обучение обращению зеркала будет связано с новым зависящим от времени процессом, который сопоставляет цели с действиями, тогда как обучение визуальному повороту будет поддерживаться перекалибровкой существующей политики управления и, следовательно, не требует дополнительного времени обработки.

Мы проверили эту идею, применяя быстрые RT во всех достигаемых задачах. Для обучения MR (эксперимент 1; рис.3 A ), RT увеличились в начале MR на 145 мс (± 18 мс SE), t ₍₁₄₎ = -8,232, p <0,9,8 × 10 ⁻⁷ . RT достигли плато в поздних блоках MR второй сессии и приблизились к уровням базовых показателей. Однако, когда визуальная обратная связь переключилась обратно на необратное отображение в блоке 25, RT сначала увеличились, но впоследствии уменьшились до 272 мс (± 5 мс) в последнем блоке, давая почти значительно более короткие RT, чем в последнем блоке MR ( t ₍₁₄₎ = 2.123, p = 0,052). Таким образом, даже после 2 дней тренировки движения в МРТ требовали немного больше времени на подготовку, чем в обычных условиях.

Рис. 3. Среднее время реакции для группы

в экспериментах 1 и 2. Белый фон представляет достижение при нормальной визуальной обратной связи, тогда как серый фон представляет достижение во время перевернутой или перевернутой визуальной обратной связи. Вертикальная линия указывает перерыв между сеансами. A , RT для целей −160 °, −20 °, 20 ° и 160 ° во время обучения зеркальному обращению (эксперимент 1). B , RT для достижения 8 целей во время VR (эксперимент 2). Планки ошибок указывают на межсубъектную SE.

Для эквивалентного эксперимента VR (эксперимент 2, рис. 3 B ) мы ожидали, что RT увеличится в меньшей степени, если вообще увеличится. Среднее время RT увеличилось на 45 мс (± 8 мс), когда вращение было впервые введено ( t ₍₂₈₎ = -2,918, p = 0,007) (рис. 3 B ). Таким образом, прирост RT во время обучения VR был значительно меньше, чем прирост во время обучения MR ( t ₍₂₈₎ = −5.170, p = 1,74 × 10 ⁻⁵ ). Во второй день обучения ни один из блоков VR больше не отличался значимо от исходного уровня (блок 13: t ₍₁₄₎ = -1,683, p = 0,114). После того, как вращение было размыто (последний блок), RT были незначительно короче, чем в четвертом блоке обучения ( t ₍₁₄₎ = -1,256; p = 0,23). Таким образом, мы обнаружили, что визуальные вращения вызывали менее одной трети увеличения RT по сравнению с зеркальными переворотами.

Наше главное предсказание, однако, заключалось в том, что разница между двумя механизмами обучения должна стать видимой в соотношении точности времени: тот факт, что для данного состояния адаптации испытания с более длинными RT показывают меньшие ошибки. Поскольку RT, а также ошибки движения уменьшались в ходе эксперимента, мы сначала вычли любую возможную линейную связь между числом проб и ошибкой, а также между числом проб и временем реакции для каждого участника и блока отдельно в условиях MR и VR.Затем мы построили график начального направления движения руки (в среднем от 100 до 150 мс после начала движения) как функцию RT для различных групп из 4 блоков (рис. 4). Для обучения МРТ (эксперимент 1; рис. 4 A ) углы достижения базовой линии были смещены от нуля на ∼5 °, что указывает на то, что участники проявляли склонность к движению в прямом или обратном направлении (для того, как углы были объединены по целям. (см. легенду на рис. 3), эффект, вероятно, вызван неравномерным распределением целей по кругу.

Рис. 4. Связь

между RT и ошибкой направления в экспериментах 1 и 2. Блоки 1–4 были собраны во время базовой линии, а блоки 5–24 во время MR или VR. Испытания были разделены RT для каждой цели, участника и блока. Визуальная обратная связь была достоверной во время блоков 1–4 и зеркальное отражение или вращение во время блоков 5–24. Блоки 1–12 измерялись во время первого сеанса, блоки 13–24 — во время второго сеанса. A , Реверс зеркала: визуальные ошибки от движений к цели -160 ° и 20 ° были перевернуты, чтобы обеспечить усреднение с ошибками для целей -20 ° и 160 °.Визуальные ошибки <20 ° указывают на то, что рука потянулась в неправильном (незеркальном) направлении. Совершенно неадаптированные ответы приведут к ошибке 40 °. B , Визуальное вращение. Совершенно неадаптированный ответ приведет к ошибке 40 °. Планки ошибок указывают на межсубъектную SE.

Чтобы определить, существует ли компромисс между точностью и точностью, мы вычислили наклон регрессии между ошибкой и RT по интервалам (см. «Материалы и методы») (рис. 4). В эксперименте MR (блоки 1–4) наблюдался небольшой, но значительный отрицательный наклон ( t ₍₁₄₎ = −4.477, p = 0,001) на исходном уровне. С началом обучения MR (блоки 5–8) наклон стал значительно более отрицательным по сравнению с исходным уровнем ( t ₍₁₄₎ = 5,004, p = 1,93 × 10 ⁻⁴ ). Для длительных RT участники производили правильно отраженные движения. Однако для самого быстрого бункера RT движения начинались в направлении визуально представленной цели, а не в противоположном, правильном направлении; ошибка была значительно больше 20 °, где ошибка 20 ° означает движение к оси поворота зеркала ( t ₍₁₄₎ = 3.812, п. = 0,001). По мере продолжения обучения связь между RT и ошибкой движения сохраняла одинаковые наклоны во всех группах из 4 блоков (дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями с группами из 4 блоков в качестве внутрисубъектного фактора: F _(4,56) = 0,588, p = 0,673). Даже в конце обучения в Эксперименте 1 разница в соотношении RT-ошибка все еще была значительной по сравнению с исходным уровнем ( t ₍₁₄₎ = 3,995, p = 0,001).Однако кривая точности времени сдвинулась в сторону, так что более высокая точность могла быть достигнута при более коротких RT. Чтобы количественно оценить это наблюдение, мы рассчитали RT, необходимое для уменьшения ошибки до 12 °, поскольку этот момент времени позволил провести оценку для всех групп из 4 блоков эксперимента (рис. 4 A ), предполагая приблизительно линейную зависимость между ошибка и RT в протестированном здесь диапазоне и линейное предсказание времени реакции для ошибки 12 ° для каждого участника и четырех блоков.Мы обнаружили существенные различия между блоками 5–8 и 9–12 ( t ₍₁₄₎ = 2,405, p = 0,031), блоками 13–16 ( t ₍₁₄₎ = 4,836, p = 2,64 × 10 ⁻⁴ ), блоки 17–20 ( t ₍₁₄₎ = 3,769, p = 0,002) и блоки 21–24 ( t ₍₁₄₎ = 3.860, p = 0,002). Аналогичным образом, мы обнаружили значительные горизонтальные сдвиги между блоками 9–12 и блоками 13–16 ( t ₍₁₄₎ = 2.806, p = 0,014), блоки 17–20 ( t ₍₁₄₎ = 3,405, p = 0,004) и блоки 21–24 ( t ₍₁₄₎ = 3,353, p = 0,005), что означает, что каждая кривая на 2-й день была значительно сдвинута по сравнению с каждой кривой на 1-й день. Другими словами, MR-тренировка привела к автоматизации нового сопоставления цели-движения, видимого в сдвиге времени. -точность компромисса.

Напротив, мы предположили, что обучение виртуальной реальности (эксперимент 2) достигается путем повторной калибровки существующей политики управления.Таким образом, участники должны иметь возможность использовать автоматичность старого сопоставления даже во время обучения и, таким образом, не должны требовать дополнительного времени для обработки. Следовательно, мы предсказали, что для обучения виртуальной реальности более длительное время реакции не должно приводить к меньшему количеству ошибок. Это действительно то, что мы обнаружили (рис. 4 B ). На исходном уровне была небольшая, но достоверно положительная связь между ошибкой и RT ( t ₍₁₄₎ = 3,453, p = 0,004). Однако с введением VR это соотношение не изменилось ( t тест между наклонами блоков 5–8 и блоков 1–4: t ₍₁₄₎ = −1.442, p = 0,171). Таким образом, хотя угловые ошибки увеличивались, как только визуальный дисплей был повернут (блоки 5–8), более длинные RT не привели к меньшим ошибкам. В последующих блоках ошибка еще больше уменьшалась, но изменения зависимости от RT не наблюдалось ( t тест между наклонами блоков 21–24 и блоков 1–4: t ₍₁₄₎ = 0,503 p = 0,623).

Хотя диапазон RT между экспериментами 1 и 2 немного отличался, распределение RT значительно перекрывалось, особенно на более поздних этапах обучения.Чтобы напрямую сравнить условия MR и VR, мы пересчитали наклоны между RT и углом охвата для 4 самых быстрых интервалов во время MR и самых медленных 4 интервалов во время обучения VR, так что среднее время реакции, используемое для вычисления углов в MR (292 ± 9 мс) и VR (279 ± 9 мс) существенно не различались ( t ₍₂₈₎ = 1,053, p = 0,301). После вычитания наклонов базовой линии из всех других фаз мы обнаружили, что на всех фазах наблюдалась значительная разница между наклоном временной точности условий обучения MR и VR (блоки 5-8: t ₍₂₈₎ = 4 .429, p = 1,4 × 10 ⁻⁴ ; блоки 9–12: t ₍₂₈₎ = 5,101, p = 2,1 × 10 ⁻⁵ ; блоки 13–16: t ₍₂₈₎ = −4,781, p = 5,05 × 10 ⁻⁵ ; блоки 17–20: т ₍₂₈₎ = 3,420, п = 0,002; блоки 21–24: t ₍₂₈₎ = −4,401, p = 1,4 × 10 ⁻⁴ ). Таким образом, в сопоставимом диапазоне RT группа обучения MR явно показала значительно более сильную зависимость точности от RT, чем группа обучения VR.

Адаптация быстрой обратной связи

Второе окно понимания того, как вычисления в двигательной системе разворачиваются с течением времени, — это исследование быстрых откликов обратной связи. Если новая политика управления требует больше времени для вычисления моторной команды, тогда отклики обратной связи после обучения также должны быть отложены, или, возможно, в ранних ответах должна преобладать старая политика. Если, однако, существующая политика была перекалибрована, то и ранний, и поздний компоненты обратной связи должны адаптироваться одновременно.

Чтобы ответить на этот вопрос для обучения обращению зеркала, эксперимент 3 исследовал реакции руки на внезапные перемещения курсора (Sarlegna et al., 2003). Затем мы вычислили разницу между силовыми реакциями на прыжки курсора влево и вправо и сократили ее вдвое, чтобы проверить временную эволюцию коррекции обратной связи в разных группах из 4 блоков эксперимента. На рис. 5 показаны результаты, усредненные по четырем условиям консолидации. Во время незеркальных движений базовой линии корректирующий ответ начинался примерно через 110 мс после начала смещения и достигал ∼1 Н через 250 мс.В первых 4 зеркально перевернутых блоках (блоки 5–8) он все еще достигал ∼0.8N в том же направлении, но после этого стал менее устойчивым; во временном окне 250–350 мс он был значительно ниже, чем на исходном уровне, t ₍₆₀₎ = 8,35, p = 1,2 × 10 ⁻¹¹ . Этот необратимый ответ скорее увеличит визуальную ошибку, чем скомпенсирует ее (рис. 1). В блоках 9–12 силовая реакция еще больше уменьшилась, но все еще не изменилась. Только в течение второго дня (блоки 13–24) мы наблюдали инверсию силового отклика во временном окне 250–350 мс (блоки 13–16, –0.14 ± 0,038N, t ₍₆₀₎ = −3,695, p = 4,8 × 10 ⁻⁴ ). Однако даже в блоках 21–24 исходная неправильная силовая реакция не была полностью устранена: во временном окне между 130 и 200 мс она оставалась значимо положительной (0,13 ± 0,018 Н, t ₍₆₀₎ = 8,028, p = 4,3 × 10 ⁻¹¹ ).

Рис. 5.

Взаимосвязь между временем и откликом обратной связи во время обучения зеркальному обращению (эксперимент 3). Показана сила, измеренная в канале в ответ на 1.Перемещение курсора на 5 см. Блоки 1–4 были собраны во время исходного уровня, а блоки 5-24 — во время MR. Линия через дефис указывает на обратную базовую реакцию, чтобы служить иллюстрацией того, как могла бы выглядеть полностью обратная обратная связь. Заштрихованная область представляет собой SE между субъектами.

В целом, ответы обратной связи во время обучения MR дают очень похожую картину, что и ответы с прямой связью. В то время как система генерирует правильные движения после дополнительного времени обработки, быстрые и автоматические реакции оставались неадаптированными даже после 2 тренировок (Гриценко и Каласка, 2010).Данные ясно показали прогрессирование обучения, при котором правильный ответ постепенно генерировался с более короткими задержками, что свидетельствует о том, что новая политика контроля, которая изначально была довольно медленной, стала автоматизированной.

Определение того, как команды обратной связи адаптируются во время визуального вращения, является более сложной задачей, поскольку адаптированные и неадаптированные ответы не противоположны друг другу, а отличаются только наложенным углом поворота. Чтобы усилить контраст, мы провели другое исследование (эксперимент 4), в котором участники адаптировались к повороту на 60 ° или -60 ° и исследовали обратную связь, перемещая курсор перпендикулярно движению курсора (± 90 °, рис.6 B , синие и красные стрелки через дефис). В состоянии, когда курсор был повернут на 60 °, эффективное визуальное смещение было в направлении -30 ° и 150 ° относительно движения руки. Для полностью адаптированной обратной связи рука должна корректировать перпендикулярно траектории руки, как и раньше (Рис. 6 B , сплошные красные и синие стрелки). Напротив, если реакция обратной связи не адаптирована, коррекция должна быть противоположной визуальному смещению (т. Е. На 150 ° или -30 ° относительно направления движения руки) (рис.6 B , сплошные оранжевые и голубые стрелки).

Рис. 6.

откликов обратной связи в экспериментах 4 и 5. A , В эксперименте 5 курсор (серая линия с дефисом) и рука (сплошная серая линия) двигались в одном направлении. Курсор был смещен (цветные стрелки с дефисом) на угол -90 ° (темно-синий), -30 ° (голубой), 90 ° (красный) или 150 ° (оранжевый) относительно направления движения. Смещения также произошли в направлениях 30 ° и -150 ° (данные не показаны).Движения руки, которые компенсируют смещения курсора, показаны сплошными стрелками того же цвета. B , В эксперименте 4 курсор (серая линия с дефисом) был повернут на 60 ° или -60 ° (на схеме показан только 60 °) от движения руки (сплошная серая линия). Смещения составляли -90 ° (с синим дефисом) или 90 ° (с красным дефисом) относительно направления движения курсора. Сплошные красные и синие стрелки указывают необходимые направления движения руки, которые компенсируют соответствующее смещение (стрелка с дефисом того же цвета).Оранжевая и голубая стрелки показывают, как будет выглядеть неадаптированный ответ. C , Колчан график откликов обратной связи в эксперименте 5 до -90 ° (темно-синий) и 90 ° (красный) смещения курсора. Начало вектора представляет собой среднее положение руки в моменты времени от 75 до 375 мс после смещения курсора (разрешение 20 мс), а вектор — разницу в мгновенной скорости руки между испытаниями со смещением и без смещения. D , Реакция обратной связи на смещения курсора на -30 ° (голубой) и 150 ° (оранжевый) в эксперименте 5. E , реакция на смещения курсора на -90 ° (темно-синий) и 90 ° (красный) во время достижения базовой линии (то есть до поворота курсора в эксперименте 4) и ( F ) с повернутым курсором (блоки 5 –8). Результаты показаны усредненными по группам вращения на 60 ° и -60 °, с переворачиванием результатов для группы -60 ° вправо-влево. G , Среднее угловое направление коррекции обратной связи (± SE) 250–350 мс после смещения, нанесенного на график по всем блокам эксперимента 4.Отклики объединяются по смещениям курсора и группам вращения. Светло-синий фон представляет блоки с визуальным вращением. Синяя линия и штриховка представляют собой прогноз полностью неадаптированной реакции обратной связи на основе среднего и SE ответов на наклонное смещение курсора в эксперименте 5. H , Средняя угловая ошибка команды прямой связи (± SE), усредненная от 100 до 150 мс. после начала движения при адаптации к повороту на 60 ° в эксперименте 4 для сравнения.

Последний прогноз, однако, основан на предположении, что участники будут корректировать движение своей руки, противоположное визуальному смещению курсора, даже если смещение не было ортогональным направлению движения.Поскольку возможно, что двигательная система меньше реагирует на компонент визуального смещения в направлении движения, мы проверили наше предположение в дополнительном эксперименте. В эксперименте 5 мы смещали курсор на 1,5 см под углом ± 30 °, ± 90 ° и ± 150 ° относительно движения руки и курсора (рис. 6 A ). Даже для наклонных углов начальная коррекция должна быть прямо противоположной смещениям курсора.

Мы использовали разницу между мгновенными векторами скорости между испытаниями со смещениями и без них в разные моменты времени после смещения в качестве меры корректирующей реакции.Мы обнаружили, что для смещений на 90 ° при естественном отображении векторы разности скоростей были слегка наклонены вниз, что означает, что рука не только корректировалась в соответствующем направлении, но также замедлялась вдоль основного направления движения (Рис. ). Чтобы суммировать эффекты по направлениям смещения в автономном режиме, мы повернули вектор коррекции для смещений -90 ° на 180 °, эффективно нейтрализуя любой эффект замедления.

Для наклонных смещений мы обнаружили, что поправки были примерно противоположны смещению (рис.6 D ). Для совместного анализа откликов мы инвертировали горизонтальную составляющую откликов на смещения на 150 ° и 30 ° и вертикальную составляющую откликов на смещение ± 150 °, так что все поправки накладывались на поправку на -30 °. Смещения на ° (что требует поправки на 150 ° для полной компенсации). Угол полученной коррекции составил 136,4 ° (± 9,1 °), что немного меньше идеальной реакции в 150 °, что указывает на то, что участники реагировали на смещения в направлении движения немного меньше, чем на смещения, перпендикулярные ему.Таким образом, основываясь на этих результатах, мы могли бы ожидать, что полностью неадаптированная реакция обратной связи на смещение курсора против часовой стрелки (-90 °) при повороте курсора на 60 ° должна быть 136,4 °.

В эксперименте 4 мы усреднили результаты групп вращения на 60 ° и -60 °, перевернув траектории для группы, которая подверглась вращению на -60 °. Средние отклики обратной связи во время обучения виртуальной реальности (рис.6 F ) не походили на отклики обратной связи, наблюдаемые в контрольном эксперименте (рис.6 D ). Скорее, поправки были ориентированы на –90 ° и 90 ° относительно направления движения. Другими словами, реакция обратной связи в VR оказалась сразу же ориентированной в правильном направлении (рис. 6 G ). Хотя мы не можем напрямую сравнивать силы, измеренные в эксперименте 3, с векторами скорости, измеренными в эксперименте 4, эти результаты резко контрастируют с медленной и неполной адаптацией быстрой обратной связи во время обучения MR.

Таким образом, наши результаты указывают на фундаментальное различие в способах обучения MR и VR.Изначально обучение MR требует дополнительного времени обработки для вычисления точных команд прямой связи и обратной связи, что указывает на то, что оно может включать в себя создание новой политики управления. Хотя новые моторные команды можно было генерировать быстрее после двух дней обучения, это оставалось зависимым от времени обработки. Напротив, обучение в виртуальной реальности не показало такой зависимости даже на ранних этапах обучения, что согласуется с идеей о том, что полностью автоматизированная политика управления была перекалибрована.

Повышение производительности в автономном режиме между сеансами

Благодаря изменяющемуся компромиссу времени и точности MR-обучение разделяет важную особенность с другими задачами моторного обучения (Beilock et al., 2008). Недавно было высказано предположение, что такие сдвиги следует рассматривать как определяющую черту «обучения навыкам» (Reis et al., 2009; Shmuelof et al., 2012). Еще одна характеристика многих задач, которые считаются «умелыми» задачами, касается консолидации между сессиями: например, при обучении последовательным движениям уровни производительности обычно очень незначительно ухудшаются за ночь (Rickard et al., 2008), а иногда даже, кажется, демонстрируют рост в автономном режиме ( Stickgold, 2005; Wright et al., 2010; Abe et al., 2011). Напротив, адаптационные задачи, требующие повторной калибровки существующей политики контроля, почти всегда демонстрируют некоторый спад моторной памяти в течение промежуточного интервала (Tong et al., 2002; Klassen et al., 2005; Krakauer et al., 2005; Trempe). и Proteau, 2010). Если эту разную временную динамику консолидации можно отнести к предлагаемому различию автоматизации новой политики управления по сравнению с перекалибровкой существующей политики управления, тогда MR-обучение должно показывать автономный выигрыш в перерыве между двумя сессиями, тогда как VR-обучение должно отображаться в автономном режиме. забывая.

Часто сообщается, что прирост в автономном режиме в экспериментах по обучению навыкам зависит от сна (Walker et al., 2002; Cohen et al., 2005; Robertson et al., 2005; Stickgold, 2005; Rickard et al., 2008). Поэтому для обучения MR в эксперименте 3 мы случайным образом распределили участников в одну из четырех групп. Группа ME проводила первую сессию утром и вторую сессию вечером того же дня, и, следовательно, не спала ночью между двумя сессиями. Группа EM провела первое занятие вечером, а следующее занятие утром следующего дня.У обеих этих групп был перерыв в 12 часов между двумя сессиями. Чтобы проверить, зависит ли потенциальная разница от времени дня первого или второго сеанса, а не от наличия или отсутствия сна, мы включили две дополнительные группы, которые проводили эксперимент либо по утрам (MM), либо по вечерам ( EE) 2 дня подряд. Если консолидация действительно зависела от сна, а не от времени суток, то только группа ME (единственная группа без сна) должна показать худшую консолидацию, чем любая из трех других групп, тогда как другие три группы не должны отличаться друг от друга.

Поскольку ошибка зависела от RT и поскольку RT может отличаться от одного сеанса к другому, мы количественно оценили уровень навыков как ошибку движения, которую участник будет показывать для фиксированного RT. Слегка нелинейная связь между ошибкой и RT была установлена ​​с использованием регрессии гауссовского процесса (см. Материалы и методы), а затем мы просто считали ошибку перемещения для RT, равного 250 мс. Ошибки от движений к цели 20 ° были инвертированы, чтобы можно было усреднить направленную ошибку с поправкой на RT для обеих периферийных целей.

Мы обнаружили, что MR-обучение не показывало забывчивость между сессиями, а скорее показывало прирост производительности в автономном режиме (рис. 7). Во всех группах наблюдалось значительное улучшение производительности прямой связи от последнего блока первого сеанса к первому блоку второго сеанса ( t ₍₆₀₎ = -4,72, p = 1,4 × 10 ^{— 5} ). При индивидуальном тестировании группа EM ( t ₍₁₄₎ = −2,678, p = 0,018), группа EE ( t ₍₁₂₎ = −3.174, p = 0,008), а группа MM ( t ₍₁₆₎ = −2,138, p = 0,048) — все значительно улучшилось за ночь. Единственной группой, которая не показала значительных улучшений, была группа ME ( t ₍₁₅₎ = -1,872, p = 0,081), у которой не было ночи сна между двумя сеансами. Однако не было значительных прямых различий между группой без сна и группами с ночным сном между двумя сеансами с точки зрения их изменения ошибки движения от сеанса 1 к сеансу 2 ( t ₍₅₉₎ = — 1.471, p = 0,147).

Рис. 7.

Объединение команды прямой связи в экспериментах 2 и 3. Средние угловые ошибки через 100–150 мс после начала движения нанесены на график по различным блокам эксперимента ( A – D ) для четырех групп зеркального поворота ( Эксперимент 3) и ( E ) группа визуального вращения (эксперимент 2). Ошибка исправляется с учетом влияния компромисса на точность времени путем вычисления средней ошибки при RT = 250 мс (см. Материалы и методы).Цветной фон представляет блоки с зеркальным разворотом или визуальным вращением. Вертикальная линия, разделенная дефисом, разделяет две сессии. Все группы зеркального реверсирования работали так же или лучше в первом блоке второго сеанса, чем в последнем блоке первого сеанса. F , Гистограмма разницы ошибок между первым блоком во втором сеансе (блок 13) и последним блоком в первом сеансе (блок 12), разделенная на визуальное вращение и четыре группы зеркального разворота: ME, EM, EE, MM; и группа VR.* p <0,05 (достоверно t тест против 0). Планки ошибок указывают на межсубъектную SE.

Прирост

Offline был еще более заметен в корректировках обратной связи (рис. 8). Для этого анализа мы усреднили отклик обратной связи (рис. 5) за интервал от 250 до 350 мс после смещения, так как этот период времени показал наиболее глубокие изменения, связанные с обучением. Опять же, все участники вместе показали очень сильный прирост офлайн ( t ₍₆₀₎ = −4.637, p = 1,9 × 10 ⁻⁵ ). Мы также построили график зависимости этого показателя от блока для всех четырех групп отдельно. Группа EM ( t ₍₁₄₎ = 2,265, p = 0,04), группа EE ( t ₍₁₂₎ = 3,011, p = 0,011) и группа MM ( t ₍₁₆₎ = 2,656, p = 0,017) показал значительный рост производительности от одного сеанса к другому. Единственной группой, которая не показала улучшений, была группа ME ( t ₍₁₅₎ = 1.189, p = 0,253) (т. Е. Группа, у которой не было сна ночью между двумя сеансами). Группы со сном имели лишь незначительно больший выигрыш в автономном режиме, чем группа без сна ( t ₍₅₉₎ = 1,837, p = 0,071), что указывает на то, что улучшения в автономном режиме могли быть усилены сном. Не наблюдалось значительного влияния времени суток первого ( t ₍₅₉₎ = 1,220, p = 0,227) или второго сеанса ( t ₍₅₉₎ = 0.650, p = 0,518), также не было влияния продолжительности перерыва между сессиями ( t ₍₅₉₎ = 1,314, p = 0,194). Вместе эти результаты ясно демонстрируют наличие преимуществ в автономном режиме во время обучения MR. Что касается зависимости этого эффекта от сна, наши результаты остаются неубедительными. Несмотря на то, что в данных есть некоторые тенденции, указывающие на то, что прерывистый ночной сон может усилить этот эффект, прямое сравнение групп не имело значения.

Рис. 8.

Объединение команды обратной связи в эксперименте 3. Среднее значение команды обратной связи через 250–350 мс после смещения нанесено на различные блоки эксперимента. Цветной фон представляет собой зеркальное отражение визуальной обратной связи. A – D , Команды обратной связи четырех групп реверсирования зеркала. E , Гистограмма разностей сил между первым блоком во втором сеансе (блок 13) и последним блоком в первом сеансе (блок 12), разделенными на четыре группы: ME, EM, EE и ММ.* p <0,05 (достоверно t тест против нуля). Планки ошибок указывают на межсубъектную SE.

В отличие от MR, обучение в виртуальной реальности показало явное забывание между сессиями, что соответствует многим другим задачам адаптации (Tong et al., 2002; Klassen et al., 2005; Krakauer et al., 2005; Trempe and Proteau, 2010). Хотя мы не обнаружили существенной связи между RT и угловой ошибкой, мы использовали для согласованности тот же метод коррекции RT, что и для данных MR.В течение первых суток начальная ошибка уменьшилась с 24,4 ° (± 2,1 °) до 8,7 ° (± 1,5 °) (рис. 7 E ). Когда участники вернулись на второй день, их ошибка снова увеличилась до 14,7,2 ° (± 3 °). Угловые ошибки в первом блоке второго сеанса были значительно больше угловых ошибок в последнем блоке первого сеанса ( t ₍₂₈₎ = −2,192, p = 0,049; Рис.7 F ) . Таким образом, наши результаты подтверждают предыдущую литературу, показывающую, что адаптация забывается между сессиями, и предоставляют доказательства явной диссоциации от МР-обучения, для которой наблюдаются автономные достижения.

Обсуждение

Мы прямо противопоставили обучение двум различным зрительно-моторным трансформациям. Для MR-обучения мы обнаружили четкую RT-зависимость начальной ошибки движения, при которой более быстрые ответы приводят к большим ошибкам, чем медленные. Мы предположили, что MR-обучение включает в себя получение нового сенсомоторного отображения, которое изначально требует больше времени, чем старое отображение, для выполнения необходимых вычислений. Таким образом, при жестких временных ограничениях ответ по-прежнему определялся старым отображением.За 2 дня обучения мы обнаружили, что новое отображение становится все более автоматическим, достигая той же ошибки движения при более коротких RT. Однако он не обеспечил такой же автоматичности, как базовое картирование.

Для обучения VR ошибка движения не уменьшалась с увеличением RT. Мы предполагаем, что эта форма моторного обучения опирается на повторную калибровку уже существующего отображения и, следовательно, может использовать установленную автоматичность лежащих в основе вычислительных процессов. Таким образом, с этой точки зрения появление компромисса между точностью и точностью в начале обучения с последующими сдвигами этой взаимосвязи является кардинальным признаком того, что моторная система приобретает и автоматизирует новое отображение целей в моторные команды (Shmuelof et al., 2012).

Интересно, что мы обнаружили параллельную диссоциацию между MR и VR обучением во время быстрой обратной связи на смещения визуального курсора. При обучении MR корректирующая реакция была изначально направлена ​​в неправильном направлении даже после двух дней обучения (Day, Lyon, 2000; Gritsenko, Kalaska, 2010) и полностью изменилась только на поздних фазах ответа. Таким образом, управление с прямой связью и обратной связью требует дополнительного времени обработки в начале обучения, а затем все больше автоматизируется.

Напротив, команда обратной связи во время обучения VR оказалась полностью адаптированной сразу. Было высказано предположение, что обратная связь во время большого VR должна быстро адаптироваться в рамках одного испытания, потому что в противном случае рука могла бы кружить вокруг цели (Braun et al., 2009a). Другое объяснение может заключаться в том, что команде обратной связи вообще не нужно адаптироваться, потому что она всегда основывает свои реакции на относительном угле между смещением и визуально наблюдаемой траекторией.Каким бы ни был точный механизм, наличие компромиссов между точностью времени в MR и их отсутствие во время VR дает четкое свидетельство того, что два визуальных преобразования изучаются через отдельные процессы.

Предыдущее исследование показало взаимосвязь между RT и тем, как быстро участники научились визуальному вращению на 60 ° (Fernandez-Ruiz et al., 2011). Однако в этом исследовании RT были неограниченными и в среднем составляли 400–600 мс. Мы утверждали, что неограниченные RT могли потребовать стратегического перепланирования конечной точки (Mazzoni and Krakauer, 2006; Taylor et al., 2010; Taylor and Ivry, 2011), процесс, больше связанный с явным мысленным вращением желаемого направления движения (Georgopoulos and Massey, 1987; Neely and Heath, 2009), чем с зрительно-моторной адаптацией. Действительно, когда RT были ограничены <350 мс, как в нашем исследовании, не было обнаружено никаких доказательств компромисса с точностью до времени при обучении в виртуальной реальности. Таким образом, эти результаты доказывают, что даже визуальные вращения не всегда изучаются исключительно путем повторной калибровки существующей политики управления: без ограничений скорости дополнительные трудоемкие процессы (стратегическое переназначение) могут помочь повысить производительность быстрее.

Почему мозг должен изучать новую политику управления зеркальным разворотом, в то время как он, кажется, перекалибрует существующую политику управления для визуального поворота? На вычислительном уровне описания (Marr and Poggio, 1976) обучение MR и VR кажется сравнительно трудным. И то, и другое можно описать простым изменением функции, которая преобразует визуальные сигналы в движения рук. Однако то, что сложно для мозга, следует рассматривать в контексте его предшествующего опыта. В неоднозначных ситуациях моторная система, по-видимому, интерпретирует зрительно-моторные ошибки как вызванные ВР (Turnham et al., 2011), возможно, отражая внутренние предположения о структуре окружающей среды. Эти априорные факторы могут быть изменены путем многократного воздействия различных сред, этот процесс называется структурным обучением (Braun et al., 2009b). С этой точки зрения обучение МРТ будет медленным, поскольку оно нарушает изученную структуру возможных зрительно-моторных преобразований, требуя медленного усвоения новой структуры. Связанное с этим объяснение основано на предположении, что зрительно-моторное отображение адаптируется путем добавления некоторой части корректирующего отклика при старом отображении к старой моторной команде (Kawato and Gomi, 1992).Таким образом можно было бы изучить VR до 90 °, тогда как для MR первоначальная корректирующая реакция будет указывать в неправильном направлении (рис. 1), что опять же потребует установления новой политики контроля. Эта гипотеза может привести к еще не проверенному прогнозу о том, что вращение> 90 ° также должно показывать компромиссы с точностью до времени. Действительно, было высказано предположение, что такие большие вращения обучаются разными механизмами (Abeele and Bock, 2001).

Вместо того, чтобы дать четкое объяснение на уровне вычислений, основной эмпирический вклад статьи состоит в том, чтобы показать, что обучение MR и VR явно различается в отношении точности времени, как в управлении с прямой связью, так и в управлении с обратной связью.Мы предполагаем, что эти компромиссы тесно связаны с компромиссом между скоростью движения и точностью, поскольку более быстрые движения накладывают более жесткие временные ограничения на процессы обратной связи. В соответствии с нашей интерпретацией сдвиги в компромиссах между скоростью и точностью интерпретируются как знак создания новой политики контроля (Haith and Krakauer, 2013). Следуя этому определению, обучение новым траекториям (Shmuelof et al., 2012), последовательностям пальцев (Karni et al., 1995) или конфигурациям пальцев (Waters-Metenier et al., 2014) должно иметь некоторое сходство с MR-обучением.

Наш второй главный вывод заключается в том, что наличие компромисса между точностью времени связано с тем, как усвоенное поведение консолидируется между сеансами. Для обучения виртуальной реальности, для которого не было найдено компромисса между точностью времени, между сеансами происходило забывание. Это согласуется с другими исследованиями адаптации (Kassardjian et al., 2005; Krakauer et al., 2005; Galea et al., 2011). Что касается MR-обучения, мы нашли явные доказательства преимуществ автономной работы как в команде с прямой связью, так и с помощью команды обратной связи.До сих пор о преимуществах офлайн сообщалось в основном при моторном обучении последовательным движениям (Robertson et al., 2004). Наше исследование предоставляет нашим знаниям первый зарегистрированный случай улучшения офлайн для обучения зрительно-моторным трансформациям во время движений по достижению цели.

Было много споров о том, зависит ли истинное улучшение последовательных движений пальцев в автономном режиме от сна (Stickgold, 2005; Wright et al., 2010; Abe et al., 2011). Наши результаты не позволяют сделать однозначный вывод в задаче обучения MR: как для команд обратной связи, так и для команд с прямой связью, мы обнаружили тенденции, указывающие на то, что выигрыш в автономном режиме достигается за счет сна; однако прямое сравнение различных групп MR не достигло статистической значимости.Таким образом, наша неспособность найти доказательства зависимости от сна может быть частично из-за недостатка энергии, и взаимосвязь между сном и памятью в этом контексте может потребовать дальнейшего изучения.

Наличие компромисса между точностью времени и преимуществами офлайн предполагает, что механизмы обучения, лежащие в основе MR и 40 ° VR, имеют разные физиологические основы. В частности, можно предположить, что создание новой политики контроля зависит от кортикостриатных цепей. Действительно, Gutierrez-Garralda et al.(2013) показали, что пациенты с базальными ганглиями демонстрируют нормальное обучение в задаче по метанию дротиков, когда визуальная сцена смещена по горизонтали, но ухудшается производительность, когда визуальная сцена зеркально перевернута (но см. Stebbins et al., 1997; Laforce and Doyon, 2001). Базальные ганглии были связаны с выбором действия (Gerardin et al., 2004) и приобретением новых методов контроля (Doya, 2000; Middleton and Strick, 2000; Hikosaka et al., 2002; Boyd et al., 2009; Doyon). и др., 2009). Кроме того, пациенты с болезнью Паркинсона и Хантингтона плохо обучаются последовательным движениям пальцев и другим новым задачам (Gerardin et al., 2004; Boyd et al., 2009; Пенхьюн и Стил, 2012). Напротив, адаптация движений глаз (Takagi et al., 1998, 2000), движений рук (Martin et al., 1996; Tseng et al., 2007) и походки (Reisman et al., 2007) сильно зависит от целостность мозжечка, тогда как нарушения, связанные с базальными ганглиями, влияют на адаптацию в меньшей степени (Fernandez-Ruiz et al., 2003; Marinelli et al., 2009; Gutierrez-Garralda et al., 2013).

Строгая диссоциация между мозжечком как субстратом для адаптации / перекалибровки и базальными ганглиями как субстратом для выработки политики контроля недавно была поставлена ​​под сомнение с растущими доказательствами того, что мозжечок участвует как в адаптации, так и в «обучении навыкам» (Penhune and Стил, 2012).Пациенты с мозжечками плохо справляются с задачами метания дротиков со смещенной по горизонтали, а также с зеркально перевернутой зрительной обратной связью (Sanes et al., 1990; Vaca-Palomares et al., 2013).

На сегодняшний день было очень сложно определить, действительно ли какие-либо различия, обнаруженные между задачами адаптации и обучения навыкам, могут быть связаны с лежащим в основе механизмом обучения или различиями между задачами, которые используются для их измерения. Здесь мы демонстрируем, что эти два механизма по-разному участвуют в обучении двум различным зрительно-моторным картам во время движений по достижению цели.Таким образом, текущая парадигма может идеально подходить для изучения нейронных коррелятов приобретения и повторной калибровки политики управления с использованием функциональной визуализации или нейрофизиологических записей в рамках одной задачи.

.